[发明专利]一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽及其制备方法和用途

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽，本发明还涉及该抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的制备方法，本发明还涉及该抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的用途。

 

背景技术

多肽(peptide)是α-氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，也是蛋白水解的中间产物。多肽涉及人体的激素、神经、免疫调节、细胞生长和生殖各领域，其可以调节体内各个系统和细胞的生理功能，激活体内有关酶系，促进中间代谢膜的通透性，或通过控制DNA转录或影响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应。现有研究表明，来源于生物体的多肽具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗菌、抗高血压等多种活性功能，尤其是抗肿瘤活性己受到各国研究人员的极大关注。

赤魟（Dasyatis akajei）为我国沿海常见软骨鱼类，俗称鯆鱼，草帽鱼，蒲扇鱼，黄貂鱼，属软骨鱼纲，下孔总目，鲼形目，魟科，魟属。赤魟软骨中含有多种活性显著抗肿瘤因子，其分子量处于10-100 kDa之间的血管生成抑制因子备受关注。但是，该类物质具有蛋白类药物类似的缺点，即分子量大不能透过半透膜、易受体内酶和细菌以及体液的破坏、半衰期短、清除率高、生物利用度低等。因此，寻找抗肿瘤活性显著和稳定性强的低分子量多肽类物质成为软骨活性物质研究的重点。已有的研究证明蛋白质的生理功能取决于其特定的氨基酸序列，用合适的蛋白酶水解，就能释放出天然、高效、新颖的生物活性肽。基于此，以赤魟软骨为实验材料，通过对酶解和制备工艺的综合应用，将有可能获得活性显著的抗肿瘤多肽类物质，为海洋抗肿瘤药物的开发提供候选药物。

   但是，申请人研究发现，以赤魟软骨为原料，利用酶解技术制备抗肿瘤多肽的工艺研究处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性抗肿瘤多肽及其应用更是未见报道。

 

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽，该抗肿瘤多肽对前列腺癌细胞DU-145和PC-3具有显著的增值抑制作用。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的制备方法，工该艺科学合理、易于操作。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽在制备抗前列腺癌药物中的应用。

本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽，其特征在于该抗肿瘤肽的氨基酸序列为Ile-Glu-Pro-His（IEPH），ESI/MS检测给出分子离子峰m/z 495.96 Da（[M+H]⁺）。

本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）以赤魟软骨作为原料，按固液比1 g：3~8mL加入抽提液（含0.02 mol/L 2-N-吗啡啉乙磺酸和质量体积分数为0.02%EDTA的1.0 mol/L盐酸胍溶液），于18~20 ℃振荡抽提48~72 h，抽提溶液于4 ℃以下，以9 000 r/min离心15~25 min，去除沉淀，得赤魟软骨蛋白粗提液；

2）赤魟软骨蛋白粗提液加入丙酮至丙酮浓度达30%，静置0.5~1 h后，于4 ℃以下，9 000 r/min离心15~25 min，取离心上清液加入丙酮至丙酮浓度达60%，静置0.5~1 h后，4 ℃以下，9 000 r/min离心15~25 min，取沉淀于截留分子量为3 kDa 的透析袋内透析24~36 h，透析液冷冻干燥，得赤魟软骨蛋白；

3）取赤魟软骨蛋白，按照料液比1:3加入磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.5~8.5），按照软骨粗蛋白质量的1.5~2.5%加入胰蛋白酶，于温度35~45℃下酶解3~5 h，得酶解产物；

4）将制备的赤魟软骨蛋白酶解产物先经灭酶处理得赤魟软骨蛋白酶解液，再将酶解液依次经超滤、脱盐和层析，得到抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽。

作为优选，所述步骤3）中的胰蛋白酶的酶活力≥2.5×10⁴ U/g。

作为改进，所述步骤4）中的灭酶处理为：将赤魟软骨蛋白酶解产物升温至90 ℃~ 95℃，并于此温度保持10~15min后，冷却至室温，然后离心，得赤魟软骨蛋白酶解液。

再改进，所述步骤3）的超滤、脱盐和层析的具体过程为：