[发明专利]旋毛虫肌幼虫ES抗原基因疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，旋毛虫肌幼虫ES抗原基因疫苗及其制备方法。

背景技术

旋毛虫寄生于人以及多种脊椎动物体内，是引起旋毛虫病的人兽共患寄生虫病。旋毛虫可寄生于人及150多种动物体内，感染的主要原因是由于机体摄入生的或者不熟的带有旋毛虫肌幼虫包囊的肉制品而导致，若不及时诊断和治疗，可致患者死亡。据估计，目前全世界大约有1100万感染者，我国1975年后，在吉林、辽宁、黑龙江、河南、湖北等省市区也有本病暴发的报告。本病不仅严重危害人类健康，还可对养猪业及肉类出口造成巨大的经济损失，国际兽医局1998年报道了1万头生猪感染，我国26个省市区均有猪旋毛虫病的流行，在我国广大农村地区的集贸市场上常有私自屠宰后未经旋毛虫检疫的猪肉或猪肉制品出售，给人类健康和动物健康养殖带来了极大的潜在威胁。然而，目前并无有效的旋毛虫疫苗。

旋毛虫的发育阶段为成虫期、新生幼虫期和肌幼虫期三个阶段，虫体抗原成分多样，主要为表面抗原、虫体抗原、排泄-分泌抗原（ES抗原）、杆细胞颗粒相关抗原。研究表明旋毛虫ES抗原在三个时期均可以产生，是旋毛虫代谢分泌的直接暴露于宿主的免疫系统中，是宿主抗旋毛虫感染的最主要的保护性抗原，也是当前研究最为主要的旋毛虫抗原。

旋毛虫ES抗原是其天然孔分泌或者是排泄的抗原物质，不同时期的虫体都能产生此抗原物质，主要的分泌部位是虫体食道管附近的杆状细胞分泌。ES抗原是有多种蛋白成分组成，Despommier等用SDS-PAGE发现旋毛虫ES抗原中有28种抗原成分，用IEF法可发现37种抗原成分，其中糖蛋白为22种；国内学者朱兴全等也通过实验研究分析证实旋毛虫肌幼虫ES抗原的组成分非常复杂。研究发现，43ku和45ku ES 抗原能够诱导机体产生主要的保护性抗体。

旋毛虫43ku抗原是ES抗原的主要蛋白组分，在旋毛虫属内具有高度的保守性。研究表明43ku ES抗原与宿主的营养、细胞形成、排虫反应及保护性免疫应答有关,而且43ku ES 抗原糖蛋白已被作为免疫诊断和研制疫苗的良好候选抗原。

旋毛虫45 ku 抗原是一种分泌性糖蛋白, 也是旋毛虫肌幼虫ES 产物的主要抗原成分之一。Arasu等首先克隆了 45 ku抗原基因，其重组蛋白可以被旋毛虫感染小鼠血清识别。旋毛虫45 ku抗原推测是丝氨酸蛋白酶一个多基因家族，编码肌幼虫的一种蛋白，但却去除了酶的活行中心。研究还发现该抗原不仅具有良好的免疫原性，而且对于旋毛虫攻击感染具有较强的免疫保护性。最新研究表明，此基因在旋毛虫肌幼虫和成虫中都有表达，旋毛虫45 ku抗原包括肽表位和糖表位，不仅具有可形成包囊旋毛虫种所共有的抗原表位，而且具有旋毛虫种特异的抗原表位能够被单抗识别，王中全等人应用RT-PCR方法对旋毛虫45 ku抗原基因进行克隆与表达，在所扩增的890个碱基中有与美国学者报道的基因序列同源性达99.6%，这表明45ku抗原蛋白基因存在高度的保守性，是DNA疫苗研制的良好的候选基因。

DNA疫苗是指将编码某种抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。该疫苗既具有减毒疫苗的优点，同时又无逆转的危险，因此越来越受到人们的重视，被看作是继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效预防旋毛虫感染、提高减虫率的联合重组DNA疫苗及其制备方法。

旋毛虫肌幼虫重组43ku ES抗原基因的真核表达载体pVAXⅠ-43ku，它是在真核表达载体pVAXⅠ中插入了43ku基因，所述的43ku其碱基序列如序列表SEQID No.1所示；

旋毛虫肌幼虫重组45ku ES抗原基因的真核表达载体pVAXⅠ-45ku，它是在真核表达载体pVAXⅠ中插入了45ku基因，所述的45ku其碱基序列如序列表SEQID No.2所示；

旋毛虫肌幼虫ES抗原基因疫苗，它包括：由重组质粒pVAXⅠ-43ku和pVAXⅠ-45ku；

它们的重量比为1∶1；

所述的pVAXⅠ-43ku和pVAXⅠ-45ku的浓度均为1μg/μL。

旋毛虫肌幼虫ES抗原基因疫苗制备方法，包括：

（1）制备旋毛虫肌幼虫总RNA，反转录为cDNA，并以cDNA为模板，用引物：