[发明专利]植物质膜蛋白再溶解的方法及其在双向荧光差异凝胶电泳中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物质膜蛋白再溶解的方法及其在双向荧光差异凝胶电泳中的应用。

背景技术

植物细胞质膜是细胞与外界环境的屏障，也是植物细胞进行物质交换、能量转换及信息传递等重要生命活动的关键部位，在水分、无机离子、有机小分子跨膜运输，感受及传递胁迫信号等过程中发挥着重要作用。质膜功能的主要执行者是质膜蛋白，然而植物质膜蛋白丰度低，疏水性强，且大部分质膜蛋白存在糖基化、磷酸化等翻译后修饰，造成膜蛋白的微观不均一性，因此如何分离纯化和鉴定细胞膜蛋白，是植物质膜研究的难点。

植物细胞质膜蛋白的分离鉴定主要包括基于凝胶（gel-based）的方法和不基于凝胶（gel-free）的方法，大多数质膜蛋白的研究采用不基于凝胶的方法，如基于鸟枪法及1-DE-LC-MS/MS的膜蛋白分离鉴定或定量方法，这种方法自动化程度高、通量高、能够对疏水性较强的膜蛋白成功鉴定，但结果的重复性差、成本较高、数据的复杂度更高，且高丰度蛋白干涉了低丰度蛋白的鉴定，给研究带来了较多的困难。尽管有报道指出基于凝胶的双向电泳技术不适合鉴定丰度较低、疏水性强的质膜蛋白，但这种方法具有高通量、直观等特点，是当前仅有的可以同时分离大量复杂的蛋白质混合物的关键技术。有科学家通过比较不基于凝胶的方法与基于凝胶的方法在大豆叶片质膜蛋白研究中的优劣，发现gel-free的实验结果并不能完全替代gel-based的实验结果，这两种实验技术之间是很好的互补。

目前，已有一些采用双向电泳技术对植物质膜蛋白进行分析的实验，但存在着较多问题：植物质膜蛋白的提取效率低，而双向电泳技术需要的蛋白量较大；质膜蛋白疏水性较强，难溶解，难溶的质膜蛋白较难进入胶内，影响了后期的分离鉴定。Komatsu等人采用TCA/丙酮的方法沉淀了大豆叶片的质膜蛋白，并对其进行双向电泳分析，但其电泳结果不是很理想，横向拖尾较为严重。Huang等人通过添加质膜蛋白的增溶剂以溶解更多的质膜蛋白，但其电泳结果同样横向拖尾较为严重，分辨率较低。因此，提高质膜蛋白提取效率，优化质膜蛋白再溶解方法是植物质膜蛋白组学研究的难点。

近年来，新的荧光标记技术相继应用于双向电泳的研究中。2-D DIGE(two-dimensional differential gel electrophoresis，双向荧光差异凝胶电泳)是一种新出现的荧光标记定量蛋白质组学技术，它比经典的双向电泳技术具有更高的动力学范围和灵敏性，鉴定的灵敏度已达pg级，能够有效的鉴定低丰度的膜蛋白，且实验中只需50μg的蛋白，节省了双向电泳过程中质膜蛋白的用量，此技术的出现大大推进了基于凝胶的质膜蛋白组学研究。目前，适用于此技术的植物质膜蛋白提取及再溶解方法尚未报道，因此，非常有必要建立一种适用于2-D DIGE技术的植物质膜蛋白提取及再溶解方法。

植物质膜蛋白的研究多集中在甜土植物（如水稻、大豆等模式植物）中，而盐生植物是植物中的重要类群，质膜在其盐适应过程中发挥着重要作用，但是关于盐生植物质膜蛋白的研究较少。因此，建立一套既适用于甜土植物又适用于盐生植物的植物质膜蛋白提取及分离方法，为今后开展植物质膜蛋白的研究奠定基础是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物质膜蛋白再溶解的方法及其在双向荧光差异凝胶电泳中的应用。

本发明提供的植物质膜蛋白再溶解的方法，包括如下步骤：将植物质膜蛋白加入裂解液中，在冰浴中超声处理，然后涡混使所述植物质膜蛋白溶解，最后离心收集上清液，即为质膜蛋白溶液；

所述裂解液是在DIGE裂解缓冲液中加入N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷得到的，所述N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷在所述裂解液中的浓度为0.5-2g/100mL（如0.5-1g/100mL、1-2g/100mL、0.5g/100mL或2g/100mL）。所述N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷在所述裂解液中的浓度具体可为1g/100mL。

所述超声处理的参数具体可为：超声功率200W，处理时间30s，每工作3s停10s。

所述涡混的时间具体可为3h以上（如3h）。

所述离心的参数具体可为：室温、20000g离心30min。

所述DIGE裂解缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶剂为25mM Tris-HCl缓冲液（pH8.8)，所述溶质及其在DIGE裂解缓冲液中的浓度如下：7M尿素、2M硫脲和4g/100mL CHAPS（3-(3-(胆酰氨基丙基)二甲氨基)丙磺酸）。