[发明专利]生物活性胶原提取方法

权利要求书

1.一种生物活性胶原提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

前处理步骤，将新鲜牛跟腱、牛皮或猪皮用冷却纯水清洗后切成小片，采用机械搅拌、超声波处理以及阴离子表面活性剂结合的脱细胞法脱去动物组织中的细胞，将脱去细胞的组织用冷却纯水清洗，然后放入组织捣碎机中捣成组织碎屑，所述组织碎屑经清洗过滤后，再用质量百分比为0.1~1.5%的氢氧化钠溶液浸泡2~4小时，再次清洗过滤将组织碎屑备用；

酸法粗提步骤，取1重量份备用的组织碎屑于烧杯中，加入0.05~0.5mol/L的醋酸或柠檬酸溶液4~8重量份，搅拌10~20小时，使组织碎屑充分溶胀，然后用滤网进行粗过滤，将粗滤液进行高速离心，取上清液备用；

酶法去端基步骤，用氢氧化钠溶液或者碳酸钠溶液缓慢调节上清液的pH至8.0~8.5，然后加入0.1~0.3%重量份的无花果蛋白酶，搅拌均匀，酶解消化10~30小时；

梯度盐析步骤，用5~8mol/L的沉淀剂对酶解后的溶液进行多梯度盐析处理，获得溶解有胶原的溶液；

透析步骤，将溶解有胶原的溶液装入透析袋中，用0.01~0.03mol/L的醋酸溶液为透析外液，内外液体积比为5~10倍，每8小时更换一次透析外液，透析1~2天，然后将透析外液换成纯水，内外液比例5~10倍，每12小时更换一次透析外液，透析2~3天，即得到具有生物活性的胶原原液，所获得的胶原原液保留着三螺旋结构，生物活性高，热变性温度达101.57℃；

其中原料前处理步骤中所述脱细胞法具体操作如下：用质量百分比为5~10%的氯化钠溶液浸泡搅拌1~2小时，然后用超声波处理0.5~1小时，然后用质量百分比为0.2~0.3%的十二烷基磺酸钠溶液浸泡搅拌2~3小时，再用1~5%氯化钠溶液浸泡搅拌1~2小时，然后再用超声波处理0.5~1小时，然后用质量百分比为0.05~0.2%的十二烷基磺酸钠溶液浸泡搅拌2~3小时。

2.如权利要求1所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，所述透析步骤后还进行如下步骤：

超滤浓缩步骤，将透析步骤所得的胶原原液装入到超滤管中进行高速离心，获得高纯度胶原原液。

3.如权利要求1或2所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，本方法的各步骤均在不超过13摄氏度的环境温度下进行。

4.如权利要求1所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，梯度盐析步骤中，边加沉淀剂边搅拌，沉淀剂的终浓度达到2mol/L后用滤网过滤，去掉上清液，再用纯水漂洗多次，然后加入2~4重量份的0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用3mol/L的沉淀剂盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗多次，然后加入2~4重量份的0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用2mol/L的沉淀剂盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗多次，然后再加入2~4重量份的0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解。

5.如权利要求2所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，酸法粗提步骤和超滤浓缩步骤中的高速离心的转速10000~15000rpm。

6.如权利要求1或4所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，所述梯度盐析步骤采用的沉淀剂为如下试剂中的任一种：氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、磷酸二氢钾和柠檬酸钠。

7.如权利要求1所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，酶法去端基步骤中，用于调节上清液pH的试剂为质量百分比为5%的氢氧化钠溶液。

8.如权利要求1所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，原料前处理步骤中，用切片机将原料切成厚度为1~2mm的小片。

9.如权利要求1所述的生物活性胶原提取方法，其特征在于，酸法粗提步骤中采用不锈钢滤网进行粗滤。