[发明专利]生物活性胶原提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及胶原提取技术领域，具体涉及一种生物活性胶原提取方法。

背景技术

胶原是细胞外基质的一种结构蛋白，具有三螺旋结构。胶原含有18种氨基酸，不含色氨酸，是一种非完全蛋白质。胶原的特殊结构使其广泛应用于诊断、治疗、康复及美容等方面。

胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，广泛分布于角膜、皮肤、骨骼、韧带、腱等部位，是组成结缔组织的重要结构蛋白。因此从动物组织提取胶原是获得胶原的重要途径。

在提取胶原的生产过程中会产生一些副产品胶原蛋白和明胶，明胶是由胶原变性解螺旋后不再具有生物活性的肽链组成，而胶原蛋白则是胶原降解为更小的链段组成。胶原之所以具有生物活性，主要取决于它的三螺旋结构，所以明胶和胶原蛋白都是没有生物活性的。

目前，胶原的提取方法主要有碱法、酸法、盐法及酶法。

碱法提取的优点在于反应迅速彻底，其缺点在于造成胶原肽键水解，破坏胶原的三螺旋结构，使含有羟基和巯基的氨基酸破坏且产生消旋。其产生的D型氨基酸有毒，有的甚至有致癌、致畸和致突变的危害，因此，碱法提取胶原不适合用于生物医用材料用胶原的提取。

酸法提取胶原主要是通过低离子浓度及酸性环境破坏胶原分子间的盐键和Schiff键，从而使胶原纤维溶胀、溶解来提取胶原。其优点在于最大限度的保持胶原分子的三螺旋结构，即生物活性，其缺点主要是产率低。

中性盐法提取胶原的主要缺点是其工艺不稳定，使得提取的胶原分子结构也不稳定。

酶法具有水解反应快、对环境友好等优点，而且提取的胶原纯度高、物理化学性质稳定，酶解可切除胶原分子端肽的非螺旋区，降低胶原的抗原性。其缺点是水解不够彻底。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种生物活性胶原提取方法，以提取出高生物活性的胶原原液。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种生物活性胶原提纯方法，步骤如下：

前处理步骤，将新鲜牛跟腱、牛皮或猪皮用冷却纯水清洗后切成小片，引用脱细胞法脱去动物组织中的细胞，将脱去细胞的组织用冷却纯水清洗，然后放入组织捣碎机中捣成组织碎屑，所述组织碎屑经清洗过滤后，再用质量百分比为0.1~1.5%的氢氧化钠溶液浸泡2~4小时，再次清洗过滤将组织碎屑备用；

酸法粗提步骤，取1重量份备用的组织碎屑于烧杯中，加入0.05~0.5mol/L的醋酸或柠檬酸溶液4~8重量份，搅拌10~20小时，使组织碎屑充分溶胀，然后用滤网进行粗过滤，将粗滤液进行高速离心，取上清液备用；

酶法去端基步骤，用氢氧化钠溶液或者碳酸钠溶液缓慢调节上清液的pH至8.0~8.5，然后加入0.1~0.3%重量份的无花果蛋白酶，搅拌均匀，酶解消化10~30小时；

梯度盐析步骤，用5~8mol/L的沉淀剂对酶解后的溶液进行多梯度盐析处理，获得溶解有胶原的溶液；

透析步骤，将溶解有胶原的溶液装入透析袋中，用0.01~0.03mol/L的醋酸溶液为透析外液，内外液体积比为5~10倍，每8小时更换一次透析外液，透析1~2天，然后将透析外液换成纯水，内外液比例5~10倍，每12小时更换一次透析外液，透析2~3天，即得到具有生物活性的胶原原液。

进一步地，所述透析步骤后还进行如下步骤：

超滤浓缩步骤，将透析步骤所得的胶原原液装入到超滤管中进行高速离心，获得高纯度胶原原液。

进一步地，本方法的各步骤均在不超过13摄氏度的环境温度下进行。

进一步地，梯度盐析步骤中，边加沉淀剂边搅拌，沉淀剂的终浓度达到2mol/L后用滤网过滤，去掉上清液，再用纯水漂洗多次，然后加入2~4重量份的0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用3mol/L的沉淀剂盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗多次，然后加入2~4重量份的0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解，然后再用2mol/L的沉淀剂盐析，边加入边搅拌，直至没有明显的沉淀析出，滤除上清液后，漂洗多次，然后再加入2~4重量份的0.05~0.5mol/L的醋酸溶液，搅拌直至溶解。

进一步地，酸法粗提步骤和超滤浓缩步骤中的高速离心的转速10000~15000rpm。

进一步地，所述梯度盐析步骤采用的沉淀剂为如下试剂中的任一种：氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、磷酸二氢钾和柠檬酸钠。

进一步地，酶法去端基步骤中，用于调节上清液pH的试剂为质量百分比为5%的氢氧化钠溶液。