[发明专利]聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及用聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶及其制备方法和应用。

背景技术

葡萄球菌（Staphylococcus）是革兰氏阳性球菌的一种，广泛分布于自然界，如空气、水、土壤、饲料和一些物品上，也存在于人和动物的体表、鼻咽部及肠道，绝大多数不致病，少数可引起人和动物致病，其中金黄色葡萄球菌致病力最强。金黄色葡萄球菌是一种常见病菌，可引起皮肤、肺部、血液、关节、组织及器官感染，是烧伤创面感染、急性肝功能衰竭和血源性肾炎等疾病的主要病源菌。

目前主要采用抗生素治疗金黄色葡萄球菌的感染，但随着抗生素的广泛使用，耐药菌比例不断增加，开发新型抗菌剂显得尤为迫切。溶葡萄球菌酶（Lysostaphin）作为葡萄球菌细胞壁裂解酶引起了人们的重视。Schindle 等1964年首次从 Staphyloccus simulans 培养物中发现溶葡萄球菌酶（“Lysostaphin a New Bacteriolytic Agent for the Staphylococcus.”Proc. Natl. Acad. Sci. 1964，51:414-421）,该酶是含246个氨基酸组成的单链分子, 分子量为27kDa， Zn²⁺为必须的辅助因子。溶葡萄球菌酶具有内切肽酶活性, 能特异性水解细菌胞壁肽聚糖交联结构Gly五肽桥联(水解第2与第3位Gly形成的肽键)而产生破壁溶菌作用。由于Gly五肽桥联结构仅大量存在于葡萄球菌细胞壁, 其中又以金黄色葡萄球菌细胞壁中分布最广, 因此, 溶葡萄球菌酶主要对葡萄球菌尤其是金黄色葡萄球菌具有溶菌杀菌作用。

但是溶葡萄球菌酶作为异源蛋白质，在机体内的主要不良反应是产生免疫反应，引起过敏反应。静脉注射血浆半衰期短，动物药代动力学研究表明该酶进入体内1小时95%的酶已经降解。聚乙二醇（poly(ethylene glycol)，简称PEG）修饰技术的应用使PEG的许多优良特性转移到修饰蛋白中去。当PEG偶联到蛋白质分子表面时，可减少蛋白质药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快消除，并使蛋白质药物不易被免疫系统的细胞识别。PEG修饰的蛋白质药物动力学性质也发生很大的改变，半衰期延长。2003年Walsh等报道用PEG修饰溶葡萄球菌酶，采用支化的两臂单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯mPEG2-NHS。但由于该支化聚乙二醇的活性基团位于该聚合物的中点，由于位阻效应在同药物分子偶合时，使药物活性降低甚至消失。

中国发明专利申请（申请号：200710068724.X 申请日：2007-05-22）公开了溶葡萄球菌酶的制备方法和其衍生物及衍生物的制备方法。溶葡萄球菌酶的制备方法主要包括:设计并合成优化的溶葡萄球菌酶基因,构建表达载体后转化大肠杆菌工程菌,筛选高表达菌株,发酵培养工程菌,表达产物分离纯化。其中所述的表达载体质粒是PET系列载体质粒。本发明的方法,表达方案简单,表达量高,纯化工艺简单,收率高,表达产物可溶,不需要复性,直接用层析方法进行纯化,纯化收率大大提高,适合大规模制备。本发明公开的溶葡萄球菌酶衍生物由PEG修饰后免疫原性降低,半衰期延长,适合临床应用于葡萄球菌感染的治疗。

上述的方法采用直链的聚乙二醇修饰溶葡萄球菌酶，为了降低免疫原性，需要多点修饰，而修饰位点多使药物活性降低甚至消失。为此，有必要开发能够降低免疫原性同时活性下降少的聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶，更好的满足溶葡萄球菌酶在临床应用方面的需求。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供一种聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶，该溶葡萄球菌酶免疫原性降低，活性下降少，半衰期延长，适合临床应用于葡萄球菌引起的感染。本发明的第二个目的是提供上述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶的制备方法。本发明的第三个目的是提供上述的聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶的医药用途。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

聚乙二醇共价修饰的溶葡萄球菌酶，该溶葡萄球菌酶采用支化聚乙二醇对溶葡萄球菌酶进行修饰，支化聚乙二醇为含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇，并且单一活性功能基团设置在端点，所述的含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇的结构式如下：

；

所述的n1、 n2、n3分别为大于等于1的正整数，并且n1+ n2+ n3的总和为80~2000；所述的R为修饰溶葡萄球菌酶的活性功能基团。

作为优选，上述的含单一活性功能基团的Y型单甲氧基聚乙二醇的分子量为5kDa-40kDa。