[发明专利]一种有机磷农药降解酶活力检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶活力检测技术领域，具体地说是一种有机磷农药降解酶活力检测方法。

背景技术

农药残留严重危害生态环境及食品安全，对人类健康构成了巨大威胁。农药降解酶是解决农药残留的有效技术手段，具有高效、安全等特点。农药降解酶中以有机磷农药降解酶研究的较为深入，有机磷农药降解酶降解谱广泛，能够降解对硫磷、甲基对硫磷、毒死蜱、杀螟硫磷、马拉硫磷等多种有机磷农药。有机磷农药降解酶是农药降解酶领域的关键酶，具有巨大的研究与开发价值。

有机磷农药降解酶活力检测的传统方法为比色法：以甲基对硫磷为底物，甲基对硫磷被降解后生成显色物质对硝基苯酚，对硝基苯酚在410nm下有最大吸收峰，通过检测对硝基苯酚的生成量，对照标准曲线即可计算甲基对硫磷的降解量，以此来定义有机磷农药降解酶活力。此方法的优点是灵敏度高，然而随着国家对甲基对硫磷等高毒农药的禁止使用，甲基对硫磷在市场上已经停止销售，所以采用甲基对硫磷作为有机磷农药降解酶活力的检测底物已经意义不大。随着市场上中低等毒性有机磷农药（如毒死蜱）的广泛使用，寻找一种方便、灵敏的新方法重新定义有机磷农药降解酶活力具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于建立一种方便、灵敏的检测有机磷农药降解酶活力的新方法，为有机磷农药降解酶定义一个新的酶活力标准。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

（1）毒死蜱标准溶液的制备：以含有0.05%~0.5%（体积百分比）吐温80的浓度为10μM~50μM的Tris-HCl（pH8.0）缓冲液为溶剂，分别制备毒死蜱浓度为10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM的毒死蜱标准溶液。

（2）毒死蜱标准曲线的绘制：将不同浓度的毒死蜱标准溶液于291nm波长下测定吸光度，横坐标为毒死蜱浓度，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线。

（3）酶促反应体系的制备：整个酶促反应在石英比色杯中进行，将10μl~200μl待测酶液加入酶促反应体系，加入待测酶液后酶促反应体系总体积为2ml~3ml。酶促反应体系中各组分的终浓度为：Tris-HCl10μM~50μM pH7.0~9.0、吐温800.05%~0.5%（体积百分比）、毒死蜱10μM~100μM，余量为去离子水。其中，Tris-HCl为缓冲剂，为酶促反应提供稳定的pH环境，吐温80为分散剂，将毒死蜱均匀分散并溶解于反应体系，毒死蜱为酶促反应底物。

（4）酶活力检测：酶促反应在25℃~35℃条件下进行，待测酶液加入反应体系并混合均匀后立即于291nm波长下检测酶促反应1min吸光度的变化，对照毒死蜱标准曲线，计算酶活力。酶活力（U）定义为：在上述反应条件下，1min降解1μmol毒死蜱所需要的酶量。

本发明所具有的优点为：

1.本发明以目前广泛使用的有机磷农药毒死蜱作为酶促反应底物，提供了一种快速、灵敏的检测有机磷农药降解酶活力的新方法。

2.本发明所提供的一种有机磷农药降解酶活力检测方法可以用来检测有机磷农药降解酶对毒死蜱的降解率。

3.本法本发明所提供的一种有机磷农药降解酶活力检测方法可以用来筛选对毒死蜱有降解活性的酶。

附图说明

图1毒死蜱标准曲线。

具体实施方式

实施例1：有机磷农药降解酶OPH（GenBank登录号：AY766084）酶活力的检测

（1）毒死蜱标准溶液的制备：以含有0.1%（体积百分比）吐温80的浓度为20μM的Tris-HCl（pH8.0）缓冲液为溶剂，分别制备毒死蜱浓度为10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM的毒死蜱标准溶液。

（2）毒死蜱标准曲线的绘制：将不同浓度的毒死蜱标准溶液于291nm波长下测定吸光度，横坐标为毒死蜱浓度，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线。

（3）酶促反应体系的制备：整个酶促反应在4ml石英比色杯中进行，将100μl有机磷农药降解酶OPH酶液加入酶促反应体系，加入待测酶液后酶促反应体系总体积为3ml，酶促反应体系中各组分的终浓度为Tris-HCl20μM pH8.0，吐温800.1%（体积百分比），毒死蜱80μM，余量为去离子水。

（4）酶活力检测：酶促反应在30℃条件下进行，待测酶液加入酶促反应体系并混合均匀后立即于291nm波长下检测酶促反应1min前后吸光度的变化，对照标准曲线（图1），计算酶活力。酶活力（U）定义为：在30℃，pH8.0的条件下，1min降解1μmol毒死蜱所需要的酶量。