[发明专利]一种利用2-DE技术筛选钝齿棒杆菌内源高表达启动子的方法

权利要求书

1.一种利用2-DE技术筛选钝齿棒杆菌内源高活性启动子的方法，其特征是：

通过2-DE技术筛选钝齿棒杆菌内高表达蛋白质，通过MALDI-TOF-MS及MS/MS分析鉴定和数据库检索，鉴定出这些蛋白的种类，在GENBANK网站上检索出这些蛋白的编码基因序列，克隆其上游的启动子序列。

2.一种携带权利要求1中启动子片段的探测载体，其特征是：

将权利要求1中的启动子基因片段替换穿梭质粒pDXW-8上的tac-M启动子，并在其下游插入氯霉素乙酰转移酶的基因cat，获得几种启动子片段的探测载体，分别命名为pDXW-P_argC-cat、pDXW-P_argG-cat、pDXW-P_argF-cat、pDXW-P_ilvC-cat和pDXW-P_serA-cat。

3.一种携带权利要求2中探测载体的重组菌株，其特征是：

将权利要求2中的探测载体用热击转化法转化到宿主菌大肠杆菌JM109中，获得重组大肠杆菌：E.coli JM109/pDXW-P_argC-cat、E.coli JM109/pDXW-P_argG-cat、E.coli JM109/pDXW-P_argF-cat、E.coli JM109/pDXW-P_ilvC-cat、E.coli JM109/pDXW-P_serA-cat；将权利要求2中的探测载体用电击转化法转化到宿主菌钝齿棒杆菌SYPA5-5中，获得重组钝齿棒杆菌：C.crenatum SYPA5-5/pDXW-P_argC-cat、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-P_argG-cat、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-P_argF-cat、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-P_ilvC-cat、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-P_serA-cat。

4.权利要求3中重组菌的CAT酶活测定，其特征是：

将权利要求3中的重组菌株发酵测定CAT的酶活力，测得重组大肠杆菌的酶活力分别为：E.coli JM109/pDXW-P_argC-cat为0.36U/mg、E.coli JM109/pDXW-P_argG-cat为5.58U/mg、E.coli JM109/pDXW-P_argF-cat为3.81U/mg、E.coli JM109/pDXW-P_ilvC-cat为3.73U/mg、E.coli JM109/pDXW-P_serA-cat为1.26U/mg；测得重组钝齿棒杆菌的酶活力分别为：C.crenatum SYPA5-5/pDXW-P_argC-cat为0.09U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-P_argG-cat为1.86U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-P_argF-cat为1.19U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-P_ilvC-cat为1.12U/mg、C.crenatum SYPA5-5/pDXW-P_serA-cat为0.089U/mg，以上结果可以看出在重组菌中各启动子的活性：P-argG＞P-argF＞P-ilvC＞P-serA＞P-argC。这是首次获得了来自于钝齿棒杆菌内组成型高表达启动子，为钝齿棒杆菌高表达外源基因提供了有效的工具。