[发明专利]一种利用2-DE技术筛选钝齿棒杆菌内源高表达启动子的方法

说明书

技术领域

一种利用2-DE技术筛选钝齿棒杆菌内源性高表达启动子的方法，属于蛋白质组学和基因工程领域。

技术背景

双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis，2-DE)是蛋白质组研究的核心技术。2-DE技术由O Farrell和Klose于1975年分别在两个实验室独立建立，他们将高分辨率的等电聚焦(Iso-electric focusing，IEF)电泳和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)联合组成双向电泳。其基本原理是：第一向基于蛋白质等电点的不同在pH梯度胶内等电聚焦；第二向则沿着与一向垂直的方向根据分子量大小的不同进行分离，把复杂的蛋白质混合物在二维平面上分开。

随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。因此，研究启动子功能对于了解生物生长发育、探讨生物适应环境的机制及实现外源基因在转基因生物中的高效表达等均有重要意义。

钝齿棒杆菌SYPA5-5是本课题组前期筛选的一株高产L-精氨酸的突变株，L-精氨酸产量高达36g/L。其高效遗传表达体系的构建对钝齿棒杆菌改造高产L-精氨酸等代谢产物起关键作用。目前应用较为广泛的棒杆菌表达载体多采用来自大肠杆菌的启动子如P-tac和lacZ等外源启动子，这些外源启动子效率普遍不高，并且其应用受多方面因素的限制。近年来，棒杆菌内源性启动子越来越成为棒杆菌遗传表达体系研究的热点。

本发明利用2-DE技术，筛选高表达蛋白点，对这些高表达蛋白点进行MALDI-TOF-MS及MS/MS分析鉴定和数据库检索，鉴定出这些蛋白质的种类。根据数据库检索，找出其相应的编码基因序列，并克隆出其启动子序列。分别将这些启动子替换穿梭载体pDXW-8上的tac启动子，并在其下游插入报告基因氯霉素乙酰转移酶基因(cat)，并分别转化大肠杆菌JM109和钝齿棒杆菌SYPA5-5，通过测定CAT的活性，证明筛选到的这些启动子在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中均具有一定的活性，其中P-argG、P-argF、P-ilvC活性较高。

发明内容

本发明的目的在于提供：通过蛋白质组学技术和基因工程手段来筛选具有高活性的钝齿棒杆菌内源启动子的方法。对构建的重组菌株进行CAT酶活力测定发现启动子活性较高，并且这些启动子在不需要添加诱导物的条件下即能实现外源基因的高表达。为钝齿棒杆菌过量表达外源基因提供了有效的工具。

本发明的技术方案：利用2-DE技术、MALDI-TOF-MS及MS/MS分析鉴定和数据库检索，筛选出钝齿棒杆菌内源高表达蛋白质。根据数据库检索找出其编码基因序列，在基因序列的上游分离出其可能的启动子序列。通过分子克隆技术，分别将这些启动子替换穿梭载体pDXW-8上的tac启动子，并在其下游插入报告基因氯霉素乙酰转移酶基因(cat)，并分别转化大肠杆菌JM109和钝齿棒杆菌，通过测定CAT的活性，验证启动子在宿主菌中的活性。

(1)根据2-DE筛选棒杆菌内源高活性启动子：

①菌体培养菌种活化后，按5％接种量接入装液量为50mL/250mL的锥形瓶中，30℃下，200rpm(往复式摇床)发酵36h。

②蛋白样品制备及定量将培养液离心收集菌体，超纯水清洗3遍，用TE缓冲液(pH7.5)清洗2-3遍至上清澄清；用20mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.2mL PMSF溶液(10％100mM蛋白酶抑制剂)，冰浴条件下超声波破碎30min(破碎5s。间隔5s)；迅速加入100U的DNase I和20U的RNaseA，37℃下孵育30min；离心取上清加入预冷的冰丙酮，-20℃下沉淀过夜；离心收集沉淀，加入裂解液(8M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，0.5％两性电解质，1％DTT，0.001％溴酚蓝)重悬。Bradford方法蛋白质定量，-70℃保存备用。