[发明专利]生物转化法生产核苷类药物中间体阿糖胞苷的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物转化法生产阿糖胞苷的方法。

背景技术

阿糖胞苷是目前治疗急性非淋巴白血病有效的一线药物之一，属于抗代谢类化疗药物中嘧啶类似物，是2’-脱氧胞苷的结构类似物，同时又是细胞周期特异性药物。主要用于急性白血病，其中对急性粒细胞白血病疗效最好，对急性单核细胞白血病及急性淋巴细胞白血病也有效。临床应用上，一般均与其他药物合并应用，对恶性淋巴瘤、肺癌、消化道癌、头颈部癌有一定疗效，对病毒性角膜炎及流行性结膜炎等也有一定疗效。

目前阿糖胞苷的制备方法主要是化学合成法。湖南医药工业研究所等较早报道了阿糖胞苷盐酸盐的合成方法(中国医药工业，1972年07期，12-16)。该工艺由D-阿拉伯糖(I)起始，经甲醚化(II)，2，3，5位保护羟基得到(III)，水解分离出1-位羟基物(IV)，并转为对硝基苯甲酸酯(V)，继而形成氯代糖(VI)，再与二甲氧嘧啶缩合(VII)、氨化(VIII)、氢化(IX)、成盐(X)、精制而得到阿糖胞苷盐酸盐。德国专利DE2027305A和DE2601399A公开了以阿拉伯糖为初始原料进行全合成阿糖胞苷的方法，工艺较简单，但所用原料丙炔酰胺(HC＝CCN)的制备复杂，且易爆；还使用有毒物质氨基氰(H₂NCN)，对环境和人员健康有害。文献(J.Chem.Soc.Perkin.Trans I，1982，1171-1176)报道以阿糖尿苷为起始原料，与乙酐在吡啶中反应合成阿糖尿苷乙酯，然后三氮唑、三氯化磷和三乙胺在乙腈中反应后，再与阿糖尿苷乙酯反应得中间体II，最后与氨水、二氧六环混合物反应，再与甲醇氨反应得阿糖胞苷。该路线中吡啶和乙腈用量大，每克阿糖尿苷所用吡啶和乙腈用量分别在10克和22克以上，难以回收，对环境污染大，对操作人员健康不利；另外，三乙胺、三氯化磷和三氮唑用量也大。生产成本高，终产品纯度较低。专利(CN101948492A，2011年)报道了采用以阿糖尿苷为原料，与六甲基二硅胺烷(HMDS)在5-20kg公斤压力和70-160℃温度条件下反应10-80小时后，中间产物(II)在有机溶剂进行水解得到阿糖胞苷。方法工艺较简单，收率也较高，但使用的HMDS溶剂用量大；且制备中间体II需高温高压条件，对设备要求高。

从上可知，化学法生产阿糖胞苷步骤多，条件苛刻，大量使用有机溶剂，环境污染较严重，且生产成本高，工艺复杂。

目前，国内外对于生物转化法生产阿糖胞苷的文献报道很少。本发明以阿糖尿苷和胞嘧啶为原料，在全细胞下进行一步生物催化反应，从而得到阿糖胞苷。该方法选择性高、纯度高、条件温和、成本低和污染小，具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物转化法生产阿糖胞苷的方法。

本发明所提供的生产阿糖胞苷的方法，是将瑞士乳杆菌种子液接入发酵培养基中发酵培养，得到粗菌体，加入缓冲溶液得到细胞悬浮液。然后加入底物阿糖尿苷和胞嘧啶进行生物催化反应，获得阿糖胞苷转化液。离心，调节溶液pH，柱层析，解析，浓缩得到高纯度产品。

其中，所述发酵培养基由下列重量份的物质组成：酵母浸粉10-50份，葡萄糖1-10份，蛋白胨1-15份，硫酸氨1-7份，磷酸氢二钾2-12份，玉米浆2-17份，氯化钙0.5-6份，水1000份。

所述发酵培养基优选由下列重量份的物质组成：酵母浸粉20-45份，葡萄糖2-5份，蛋白胨5-10份，硫酸氨2-5份，磷酸氢二钾5-10份，玉米浆5-15份，氯化钙1-5份，水1000份。

所述发酵培养的温度为30-42℃，优选为37-40℃；搅拌转速为120-160转/分钟，优选140-160转/分钟；pH值为6.0-7.5，优选6.0-6.5；发酵时间为24-36小时。

所述瑞士乳杆菌种子液与所述发酵培养基的体积比为10％-15％。

所述瑞士乳杆菌种子液是按照如下方法获得：将瑞士乳杆菌接种到斜面培养基培养制成斜面菌种，将所述斜面菌种接入发酵培养基中培养获得种子液；所述斜面培养基由下列重量份的物质组成：葡萄糖10-20、蛋白胨10-20、酵母膏3-8、柠檬酸胺1-2、磷酸氢二钾1-2、硫酸钠5-10、硫酸锰0.02-0.4，琼脂15-20和水1000。[酵母浸粉5-20份，葡萄糖0.5-2.5份，蛋白胨1-6份，磷酸氢二钾3-12份，玉米浆0.3-1.5份，氯化钠0.5-6份，琼脂15-20份和水1000份]。