[发明专利]一种冬虫夏草发酵菌丝体活性组分的发酵及提取方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种冬虫夏草发酵菌丝体活性组分的发酵及提取方法。

（二）背景技术

冬虫夏草菌是鳞翅目蝙蝠蛾科蝠蛾属幼虫被中国被毛孢（Hirsutellasinensis）寄生后形成的虫菌复合体，是我国青藏高原的特色资源，属国家二级保护的名贵药材。

由于天然冬虫夏草具有严格的寄生性和特殊的地理生长环境，因而产量有限，加上近年采挖过度，使也是冬虫夏草资源锐减，根本无法满足保健和用药的需求。所以采用现代生物发酵技术深层发酵培养冬虫夏草菌丝体是克服利用野生资源生物量受限的最佳途径和实现有用代谢产物开发利用的基础。冬虫夏草无性型发酵的菌丝体有与天然冬虫夏草具有相同或相似的化学成分和药理作用，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血压等功效。

冬虫夏草发酵菌丝体组成复杂，含有虫草素、虫草腺苷、D-甘露醇、虫草多糖等多种生物活性成分，生物利用价值高。目前报道的提取冬虫夏草菌丝体中活性成分的方法诸如热水浸提法、水提醇沉法、醇提法等，存在着提取方法和过程单一、提取温度高、有效成分活性破坏大、无法充分提取利用好冬虫夏草菌丝体中的有效成分。

申请号为201210000824.X的中国发明专利申请中公开了一种蛹虫草腺苷的提取方法，该工艺以蛹虫草子实体经低温超微粉碎后先进行反复冻融3~7次，再模拟人体胃肠道酸碱环境，应用半仿生提取工艺对蛹虫草中的腺苷进行3次连续微波加热提取，最后用高效液相色谱仪测定提取液中腺苷的含量。该半仿生提取法存在仅以其中的虫草腺苷含量为指标，同时仍然采用了微波加热提取方式，存在易破坏虫草中的活性成分的缺点。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种冬虫夏草发酵菌丝体活性组分的气升发酵培养及仿生提取方法。

本发明采用的技术方案是：

一种冬虫夏草发酵菌丝体活性组分的发酵及提取方法，所述方法包括：

（1）种子液制备：液体种子培养基经灭菌后接入中国被毛孢菌株，50~300rpm、10~30℃下振荡培养2~35天，得到种子液；所述液体种子培养基组成如下：碳源0.5～4%，氮源0.1～2%，KH₂PO₄0.01~0.5%，MgSO₄0.01~0.5％，溶剂为水，pH6.0~7.0；所述碳源为下列之一或其中两种以上的混合物：葡萄糖、蔗糖、玉米粉、玉米淀粉；所述氮源为下列之一或其中两种以上的混合物：蛋白胨、酵母粉、蚕蛹粉、麦麸、豆饼粉；上述培养基中浓度为质量体积百分比（w/v），某组分浓度1%表示100mL培养基中含有该组分1g；

（2）发酵培养：液体发酵培养基以2～25%体积比接种量接入种子液，在气升式发酵罐中进行发酵，罐压0.02~0.07Mpa，发酵罐通气量为1:0.2V/V.min~1:3V/V.min（即每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比），培养温度15～25℃，培养时间3~40天；所述液体发酵培养基组成同液体种子培养基；当发酵菌球经显微镜镜检发现大量菌丝，残糖降至1.0%以下，视为发酵终点，放罐；

（3）菌丝体超微粉碎处理：发酵液离心后，所得菌丝体进行真空冷冻干燥，再放入超微粉碎机中于5~30℃下进行低温粉碎2~20min，得到菌丝体超微粉；

（4）发酵菌丝体仿生提取：菌丝体超微粉加入至10~50倍质量的水中，加入足量酶1，调pH值为1.0~3.0，35~37℃、40~300rpm下搅拌提取20min~150min，离心，得上清液1，取沉淀加入至10~50倍质量的水，加入足量酶2，调pH值为8.0~10.0，35~37℃、50~250rpm下搅拌提取10min~120min，离心，得上清液2；合并上清液1和上清液2，调pH值为中性，即得冬虫夏草发酵菌丝体活性组分；经检测，该组分中含有虫草素、虫草腺苷、甘露醇、多糖、SOD等活性成分；

所述酶1为下酶中的一种或多种：①胃蛋白酶、②木瓜蛋白酶、③α-淀粉酶、④凝乳酶；

所述酶2为下列中的一种或多种：①肠肽酶、②胰蛋白酶、③凝乳酶、④碱性蛋白酶。

所用酶均采用市购商品酶，通常的，胃蛋白酶酶活为10000U/g~200000U/g，凝乳酶酶活为3000U/g~30000U/g，胰蛋白酶酶活为20000U/g~1000000U/g，木瓜蛋白酶酶活为50000U/g~800000U/g，碱性蛋白酶酶活为20000U/g~400000U/g，肠肽酶500U/g~2000U/g，α-淀粉酶酶活为50000U/g~1000000U/g。