[发明专利]一种测定重组腺相关病毒滴度的定量PCR方法

说明书

技术领域:

本发明涉及定量实时荧光PCR检测重组腺相关病毒滴度的方法。 

背景技术:

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体是含有单链的DNA，无包膜，属于依赖辅助病毒的细小病毒B19家族。这种病毒是1965年Atchison等人在猿猴腺病毒15（SV-15）中发现并定义为腺相关病毒（AAV）。AAV在宿主中的复制需要宿主细胞或其他病毒的协助才能完成，如腺病毒和疱疹病毒，也因此被称为腺相关病毒。AAV病毒颗粒直经大约20nm，呈二十面体，分子量约为5.5-6.2×10⁶道尔顿，在CsCl梯度中的密度为1.39-1.42g/cm。相较于其它病毒，腺相关病毒更加稳定，可以承受60度的温度及离子去污剂的作用。AAV基因组为线性单链的正链或负链DNA，长度约为4700个核苷酸。腺相关病毒的基因组中含有两个开放的阅读框，rep和cap，两端分别有末端重复序列（ITR）。 

重组腺相关病毒（rAAV）载体因其在体内外表达效率高、表达周期长、免疫性低、无致病和致瘤性、遗传毒性低并可规模化生产等诸多优点,使其成为目前基因治疗领域非常有前途的生物载体,现已被广泛应用于临床试验且取得很好的疗效。 

然而，迄今世界上还没有形成统一的标准化的AAV滴度测定和临床剂量使用标准，给不同实验室临床试验结果间的比较造成了困难。目前国际基因治疗中应用较多的另一种腺病毒，已由腺病毒标准样品工作小组（Adenovirus Reference Material Working Group，ARMWG）根据5型腺病毒制定出标准样品指南。其对腺病毒的滴度测定和基因治疗中使用的剂量进行了统一规定。参照这一经验，美 国食品药品监督管理局（FDA）、美国国家健康研究所重组DNA顾问委员会（NIH-RAC）、美国国家基因载体实验室和来自其他9个国家的科学家共同成立了AAV标准样品工作小组（AAV Reference Standard Working Group，AAVRSWG），试图建立起AAV的标准化指南。rAAV2是基因治疗领域应用最早和最广泛的亚型，也是目前物理、化学和生物性质研究得最清楚的AAV亚型。所以标准化指南首先建立在rAAV2的基础上。该组织对rAAV2标准样品统一测定时，要求被测定的rAAV2标准样品，必须要达到在不同实验室能进行不同测定所需的量，并具有一定时间内的稳定性。同时，规定了生产和纯化rAAV2的标准指南。该组织确定，选择四个方面进行测定实施对rAAV2的质量控制：（1）使用A20酶联免疫吸附法测定rAAV2外壳滴度；（2）定量聚合酶链反应qPCR测定rAAV2的基因组滴度；（3）qPCR和增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达测定感染滴度；（4）SDS-PAGE测定病毒纯化和外壳蛋白。 

如所周知，rAAV的滴度是影响基因治疗效果的重要因素。研究发现，临床试验对病毒生产的要求为10³和10⁵DRP/cell（DNA酶-抗性颗粒/细胞，DNase-Resistant Particles/cell）。而临床试验中的剂量一般为2×10¹¹DRP/kg，需要的单批产量约为10¹⁵DRP。而且不同组织对rAAV的使用滴度要求有所不同。在眼科临床试验中，大约只需要2×10⁸DRP，而对肌肉或者肝脏疾病进行治疗时却需要1×10¹⁴DRP。目前涉及rAAV应用于临床试验的研究有81项。多数临床研究处于临床I期和II期，但是有8项临床研究已经进入III期。临床结果表明，基因表达量与rAAV的滴度成正比关系，而且大多数基因药物的疗效与表达量有很大关系，表达量太低达不到其起作用的药物需求量。某些基因药物高表达可能会导致正常功能的紊乱，从而对人体产生伤害。研究发现，rAAV对于某些病人会产生针对其外壳蛋白的免疫反应，包括抗原特异性记忆性CD8+T细胞、抗体和干扰素等。所以，rAAV的滴度测定对临床试验至关重要。而整个基因治疗领域制定标准化的滴度测定方法，将使不同实验室间临床结果比较和药物研发成为可能。目前测定rAAV滴度的方法主要检测以下几个方面：病毒颗粒滴度（Viral Particles，V.P.），基因组滴度（viral genome，V.G.），感染滴度（Infectious Particles， I.P.），转导滴度（Transduction Units，T.U.）或增强的转导滴度（Enhanced Transduction Units，E.T.U.）。