[发明专利]线粒体全基因组DNA扩增、引物、测序及突变检测

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学，特别是涉及可用于线粒体全基因组DNA扩增的引物对组、试剂盒、扩增方法、测序方法以及线粒体DNA突变检测方法。

背景技术

线粒体基因组（mitochondrial DNA,mtDNA）呈闭合双链环状结构，长度为16569bp，分为编码区和非编码区。编码区共37个基因，这37个基因中有22个编码转移核糖核酸（tRNA）、2个编码核糖体核糖核酸（12S和16S rRNA)，13个编码多肽。mtDNA基因排列紧密，序列间没有内含子。

mtDNA的分子结构特点决定其具有以下独特的遗传特性：

（1）高拷贝数，一般来说，人类体细胞的细胞核内仅有两个染色体DNA拷贝，而大多数细胞质内却有1000至数千个mtDNA拷贝；

（2）表现为严格的母性遗传特点，mtDNA随母本的卵细胞传递给后代；

（3）具有较高的突变率，大量研究显示mtDNA突变频率较核基因组高10倍以上；

（4）异质性，突变的mtDNA与野生型的mtDNA以不同比例共存于一个细胞质内。

由于mtDNA的高突变率和mtDNA的高度进化保守性，多数mtDNA新突变都为有害突变，并且mtDNA突变导致的临床表型极为广泛，几乎涉及到所有的组织和器官，许多病人并不出现典型症状，给临床诊断带来了极大的困难，很多线粒体疾病无法得到确诊。故线粒体基因组的准确检测具有重要的临床指导意义。

目前临床上对于mtDNA的检测，还仅集中在对少数常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，如对线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作（MELAS）常见突变A3243G的筛查，阳性检出率低，大多数患者难以获得准确的病因诊断。此外，这些位点的选择都是基于其他人种（主要是白种人）的实验数据，中国人的基因突变位点与欧洲人的突变位点在规律上有很大的区别。目前最常用的mtDNA的检测方法是应用聚合酶链式反应（PCR）扩增出目的DNA片段，然后采用荧光标记序列分析仪（如3730DNA序列分析仪）对扩增产物直接进行测序。由于荧光标记序列分析仪对测序片段长度的限制，需要用26对甚至更多对引物对线粒体基因组进行多重PCR，将其分割成26段甚至更多片段来进行测序，操作过于繁琐，并且无法检测拷贝数很低的变异。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

扩增线粒体基因组，可通过设计最少2对PCR引物来完成，但是，引物对数目少对DNA模板的质量要求高，基因组模板不能有过多降解，并且对Taq酶的要求也更高，需要能扩增出10kb长片段的Taq酶进行PCR，扩增片段太长同时也会增加碱基的错配率，降低检测的准确性。而设计更多对的引物来扩增线粒体基因组，如26对、43对，PCR和后续的纯化操作繁琐，PCR产物片段短，适用于线粒体基因选择部分区域做sanger测序。选用引物对数量适中，如本发明方案的8对，其优势在于，对模板的要求低，PCR产物错配率低，检测准确性高，更适用于后续的高通量测序平台。

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种可用于线粒体全基因序列扩增的引物对组。

本发明的另一目的在于提供一种线粒体全基因组DNA扩增方法。

本发明的再一目地在于提供一种线粒体全基因组的测序方法。

本发明的还一目的在于提供一种线粒体DNA的突变检测方法。

本发明的再一目的在于提供一种可用于线粒体全基因组DNA扩增的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了用于扩增线粒体全基因组序列的引物对组，所述引物对组包括以下a-h中的至少一对引物，优选含有A-H中的所有八对引物，

a、seq ID No.1:5’-CACTCCCATACTACTAATCTC-3’,

seq ID No.2:5’-TAGCATGTACTGCTCGGAGGT-3’,

b、seq ID No.3:5’-GTCCTAAACTACCAAACCTGC-3’,

seq ID No.4:5’-GTGTTAGTCATGTTAGCTTG-3’,

c、seq ID No.5:5’-ATCTCTCCCTCACTAAACGTAAG-3’,

seq ID No.6:5’-ATGAGGGCGTGATCATGAAAGGT-3’,