[发明专利]一种基于点击化学的肺炎多糖结合疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种肺炎荚膜多糖结合疫苗，以共价键的方式将肺炎荚膜多糖连接到载体蛋白上，可用于预防肺炎链球菌的感染。

2.如权利要求1所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗，所述的载体蛋白为破伤风类毒素。

3.权利要求1所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，制备的步骤包括：（1）肺炎荚膜多糖在酸性条件下水解；（2）由高碘酸钠氧化肺炎荚膜多糖，多糖中的邻位羟基氧化成醛基；（3）向氧化的肺炎荚膜多糖引入乙炔基团；（4）向破伤风类毒素引入叠氮基团；（5）将乙炔化的肺炎荚膜多糖与叠氮化的破伤风类毒素进行结合反应。

4.如权利要求3所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗的制备方法,其特征在于，肺炎荚膜多糖在50mM的醋酸钠缓冲液（pH4.7）中水解20-60分钟，水解温度为60-90℃；优化的条件为水解30分钟，水解温度为75℃。

5.如权利要求3所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗的制备方法,其特征在于，高碘酸钠氧化肺炎荚膜多糖的pH值为5.5-6.0，避光反应5-120分钟；优化的氧化条件为pH值为5.8，避光反应10分钟。

6.如权利要求3所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗的制备方法,其特征在于，由结构式为H₂N-R-C≡CH的试剂来衍化高碘酸钠氧化的肺炎荚膜多糖，同时引入乙炔基团。其中，R是碳数在0-20之间的烷基；优化的试剂为氨基乙炔。

7.如权利要求6所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗的制备方法,其特征在于，氨基乙炔衍化高碘酸钠氧化的肺炎荚膜多糖的反应条件为：在氰基硼氢化钠存在的情况下，氧化的多糖与氨基乙炔在20-40℃反应4-15小时，pH为7-8；优化的条件为于37℃反应6小时，pH为7.4。

8.如权利要求6所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗的制备方法,其特征在于，氨基乙炔衍化高碘酸钠氧化的肺炎荚膜多糖过程氧化的多糖与氨基乙炔的质量比为1:(0.5～5)；优化的质量比为1:2。

9.如权利要求3所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗的制备方法,其特征在于，用叠氮-甲酰琥珀酰亚胺活化破伤风类毒素，同时引入叠氮基团。

10.如权利要求9所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗的制备方法,其特征在于，叠氮-甲酰琥珀酰亚胺与破伤风类毒素的摩尔比为(5-60)：1，活化反应的pH值为6.0-8.0，反应温度为2-15小时；优化的活化反应条件为摩尔比为20：1，活化反应的pH值为7.4，于室温下反应4小时。

11.如权利要求3所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗的制备方法,其特征在于，（1）用2-亚氨基硫烷在破伤风类毒素上引入巯基，（2）叠氮-甲酰琥珀酰亚胺的琥珀酰亚胺基团与N-(2-氨乙基)马来酰亚胺的氨基基团反应，在叠氮-甲酰琥珀酰亚胺上引入马来酰亚胺基团，（3）马来酰亚胺化的叠氮-甲酰琥珀酰亚胺与巯基化的破伤风类毒素反应，在破伤风类毒素上引入叠氮基团。

12.如权利要求11所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，破伤风类毒素与2-亚氨基硫烷反应的摩尔比为1:(10-60)，反应pH值为6.0-8.0，反应1-24小时，于室温下反应；优化的反应条件为摩尔比为1:20，反应pH为7.4，反应4小时。

13.如权利要求11所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，叠氮-甲酰琥珀酰亚胺与N-(2-氨乙基)马来酰亚胺以摩尔比1:(0.5-4)的比例混合反应，反应pH值为6.0-8.0，反应0.5-4小时，于室温下反应；优化的反应条件为摩尔比为1:1，反应pH为7.4，反应1小时。

14.如权利要求11所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，马来酰亚胺化的叠氮-甲酰琥珀酰亚胺与巯基化的破伤风类毒素以摩尔比1:(10-60)混合反应，反应pH值为6.0-8.0，反应1-24小时，于室温下反应；优化的反应条件为摩尔比为1:20，反应pH为7.4，反应4小时。

15.如权利要求3所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，在CuSO₄和抗坏血酸存在的情况下，将乙炔化的肺炎荚膜多糖与叠氮化的载体蛋白以质量比(0.5～5):1混合反应；优化的质量比为2:1。

16.如权利要求1所述的肺炎荚膜多糖结合疫苗制剂是注射剂型。