[发明专利]一种基于点击化学的肺炎多糖结合疫苗及其制备方法

说明书

发明领域

本发明涉及生物医学领域的一种疫苗药物，具体地说涉及一种肺炎多糖结合疫苗；本发明还涉及其制备方法和免疫学评价。

背景技术

肺炎链球菌是革兰氏阳性囊状双球杆菌，可导致鼻窦炎、中耳炎、气管炎和肺炎等非侵袭性感染,也可导致脓毒症和脑膜炎等侵袭性感染。肺炎链球菌可通过病人和携带者的呼吸道分泌物传播，是导致婴幼儿、儿童和老人发病及死亡的主要原因之一。尽管可利用有效的抗生素治疗，但由该菌引起的呼吸系统疾病和侵袭性感染仍然构成重大的公共健康问题。据世界卫生组织（WHO）估计，每年约有数百万人死于肺炎链球菌感染。为保障人类健康，WHO主张接种疫苗来预防肺炎链球菌的感染。此外,随着日益广泛地使用抗生素，致使肺炎链球菌耐药菌株达96%以上，且呈现多重耐药性状况，尤其是对青霉素、头孢霉素、万古霉素、大环内酯类和氟奎诺酮类抗生素的耐药性，已成为全世界关注的严重问题之一,给治疗带来了困难。因此，通过免疫接种来预防肺炎链球菌的感染变得十分紧迫和重要。

荚膜多糖是肺炎链球菌的主要致病因子。根据荚膜的组分差异，肺炎链球菌可分成约90种血清型，但全球80%以上的感染性疾病是由约20种血清型的肺炎链球菌引起的。肺炎链球菌的保护性免疫机制主要是产生针对肺炎荚膜多糖的特异性抗体。目前上市的肺炎荚膜多糖疫苗有4价、13价及23价多糖疫苗。大多数健康成人接种肺炎荚膜多糖疫苗2～3周后,体内针对荚膜多糖的特异性抗体能升高2倍以上。但肺炎荚膜多糖是T细胞非依赖性抗原,2岁以下的儿童由于免疫系统尚未发育成熟,对大多数肺炎荚膜多糖的抗体应答反应较弱，接种剂不能达到抗体保护水平，且产生的抗体很快消失。

为解决这一问题，国内外学者转向对肺炎链球菌结合疫苗的研究，并已有7价结合疫苗上市。通过将肺炎荚膜多糖与某种载体蛋白质共价结合，使肺炎荚膜多糖转化成T细胞依赖性抗原，从而刺激婴幼儿的T细胞依赖性抗体的合成，并可产生加强应答，同时还能提高免疫球蛋白(IgG)的抗体比例。这种多糖结合疫苗不仅能够保护婴幼儿(2岁以下儿童)，还能够大大地增强抵抗力差的病人（如老人）对肺炎链球菌感染的抵抗力，因此具有十分广阔的应用前景。

细菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗最早出现在20世纪30年代，Goebel和Avery将3型肺炎球菌多糖连接到马血清球蛋白上，产生的偶联物能在动物身上产生多糖专一的抗体，同时提供相应的免疫保护。1987年，世界上第一个多糖蛋白结合疫苗，B型流感嗜血杆菌(HiB)多糖-破伤风类毒素(TT)结合疫苗被美国FDA批准进入市场。默克公司、辉瑞公司、赛诺菲-安万斯公司和诺华公司相继开发了HiB多糖-破伤风类毒素结合疫苗和流行性乙型脑膜炎多糖-破伤风类毒素结合疫苗，并成功上市。

目前唯一已上市的肺炎链球菌多糖结合疫苗为美国辉瑞公司研制的7价结合疫苗（PCV7,包含4、6B、9V、14、18C、19F和23F型；商品名：Prevenar）,已经在70多个国家获得了批准。PCV7结合疫苗可以帮助抵御系统和黏膜感染；阻止细菌在鼻咽部增殖，从而降低肺炎链球菌的流行。国内的细菌荚膜多糖结合疫苗也在起步当中，如兰州生物制品研究所、成都生物制品研究所和武汉生物制品研究所等单位在研发细菌荚膜多糖结合疫苗，包括流行性脑膜炎多糖结合疫苗和肺炎多糖结合疫苗。由于技术的限制，这些开发的产品还比较单一，结合工艺也是仿制欧美上世纪80年代的产品，产品缺乏自主知识产权。由于结合技术等原因，目前多糖结合疫苗的免疫原性和稳定性还需进一步提高，结合技术尚需进一步的改进和优化。

PCV7结合疫苗是用高碘酸钠氧化肺炎链球菌荚膜多糖的邻位羟基，氧化生成的醛基在还原剂硼氢氰化钠（NaCNBH₃）的作用下与载体蛋白（白喉毒素，CRM₁₉₇）的氨基发生胺还原反应，生成多糖-蛋白结合物。然而，该结合技术存在着以下不足之处：(1)氧化多糖产生的醛基与载体蛋白的氨基反应时间过长，需要5天以上，而且结合反应的效率较低；(2)某些多糖与载体蛋白的反应需要在较高的温度（如37°C）下进行，会影响到多糖与蛋白的结构稳定性；(3)多糖-蛋白结合疫苗的免疫原性有待进一步提高；多糖与载体蛋白的连接桥为甲氨基（-CH₂-NH-），由于甲氨基的长度过短，载体蛋白的空间屏蔽作用会遮蔽多糖分子的抗原表位，从而影响其免疫原性。