[发明专利]一种由根癌农杆菌介导的丝状真菌基因RNA干扰方法

权利要求书

1.一种重组载体PCB309-pfgrt，其碱基序列为SEQ ID NO.21。

2.如权利要求1所述的一种转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌。

3.如权利要求2所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，其特征在于，所述的根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105。

4.根据权利要求3所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，其特征在于，其通过以下方法制备：

(a)将重组载体PCB309-pfgrt采用电击的方法转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞；再用含有抗生素Kan50mg/ml和利福平25mg/的LB培养基筛选阳性克隆；

(b)用引物SEQ ID NO.9和10对步骤（a）筛选的阳性克隆进行PCR鉴定。

5.根据权利要求4所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，其特征在于，所述的PCR鉴定条件为：94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃10min。

6.一种丝状真菌基因RNA干扰方法，其特征在于，包括以下步骤：

①如权利要求3所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌与真菌细胞混合后，涂布于含200μmol/L的乙酰丁香酮的诱导培养基平板，25℃避光培养48h；

②将步骤①获得的菌落转移到筛选培养基平板上培养4天，收集生长的阳性菌落接种于沙氏培养基，4℃保存；

其中，所述的诱导培养基平板为：琼脂15g/L,K-缓冲液8ml/L,Mn缓冲液20ml/L,1%CaCl₂.2H₂O1ml/L,0.01%FeSO₄10ml/L,微量元素5ml/L，20%NH₄NO₃2.5ml/L,50%甘油10ml/L1M MES40ml/L，20%葡萄糖10ml/L。筛选培养基平板：诱导培养基平板中加入100mg/L潮霉素，200uM头孢噻肟钠。

7.根据权利要求6所述的丝状真菌基因RNA干扰方法，其特征在于，所述的真菌细胞为丝状真菌。

8.根据权利要求7所述的丝状真菌基因RNA干扰方法，其特征在于，所述的丝状真菌为申克孢子丝菌或犬小孢子菌。