[发明专利]一种由根癌农杆菌介导的丝状真菌基因RNA干扰方法

说明书

技术领域

本发明属于RNA干扰技术领域。具体涉及一种重组载体PCB309-pfgrt、用于转染的根癌农杆菌，以及由根癌农杆菌介导的丝状真菌基因RNA干扰方法。

背景技术

RNA干扰是真核生物中相对保守的基因沉默机制，它通过内源或外源双链RNA介导细胞内mRNA发生特异性降解或翻译的抑制，从而导致靶基因的表达沉默，并产生相应的功能表型缺失。1992年，Macino首次在粗糙脉胞菌中发现真菌中存在RNAi的现象后，RNAi技术渐成为一种对真菌进行遗传改造的新手段。在丝状真菌中RNAi技术具有特殊的优势：不受丝状真菌的多核现象、异核现象和非同源重组频率高的干扰，特别是当需要使多个基因的表达同时下调时，使用RNA干扰比基因敲除更加方便。然而，真正将RNAi技术用在丝状真菌的各项研究时还存在很多问题：真菌细胞多为多倍体，细胞壁含有较多的多糖及多糖蛋白等成分，使得RNA沉默的效果并不如在原生、动物细胞中理想，存在干扰效率低下、有脱靶效应等缺陷。因此选择恰当的遗传转化方法并制备合适的转染载体，可以更高效的导入siRNA，保证导入siRNA的稳定性，有效延长RNAi的作用时间，进而大大提高靶基因抑制效率，更好的对丝状真菌进行基因改造。

目前存在的遗传转化方法众多：CaCl₂/聚乙二醇法，醋酸锂转化法，电穿孔转化法，粒子轰击法和根癌农杆菌转化法。与其他方法相比，在丝状真菌的研究中根癌农杆菌转化法具有如下优势：①不需制备原生质体，各种类型的完整细胞（如分生孢子，菌丝体，子实体）均可作为转化受体。②产生的突变子大多数为单拷贝插入，其标签基因的分离更容易。③插入随机性更好，亦能用于同源重组。由此可见，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化方法不失为真菌遗传学研究领域的一种重要手段，而构建适于农杆菌介导的、能够转染丝状真菌的干扰载体尤为必要。常用的植物双元表达载体都比较大，多数在10kb以上。做载体构建时操作困难，转化效率低，而且可用的单一酶切位点很少。本发明对现有的植物双元表达载体进行改造，而改造后的载体只有3.5Kb，并加入了多克隆位点，从而适于真菌基因的干扰沉默研究中。另外，目前文献报道干扰载体的适用范围多较局限，为种属特异性，仅适于皮肤癣菌属/青霉菌属/曲霉菌属，大大限制了其应用范围。本发明将改造后的载体加入了真菌通用启动子Ptrpc、间隔序列和终止子Ttrpc，并引入了潮霉素抗性基因，使其在间隔序列两侧加上目的基因的正反向干扰序列后即可广泛用在多种真菌基因干扰的研究中。现存的很多真菌基因干扰方法存在转化效率低，稳定性差等缺点，本发明使用根癌农杆菌的转化体系，并对转化体系中诱导剂的种类和浓度，培养时间，培养温度，根癌农杆菌与受体菌浓度之比等条件参数进行优化，提高了转化效率，保证了导入siRNA的稳定性，明显提高了吧基因的抑制效率。

发明内容

本发明提供了一种由根癌农杆菌介导的适于多种丝状真菌基因研究用的RNA干扰方法，具体如下：干扰载体构建，包括干扰载体的序列特征，目的基因正反相干扰序列替换的位置，载体构建的具体条件；根癌农杆菌转化体系中供体菌与受体菌浓度之比，培养温度，培养时间，诱导剂种类和浓度等条件参数。

为有效提高RNAi技术对丝状真菌靶基因的抑制效率，本发明采用的技术方案内容有：

（一）对于重组载体PCB309-pfgrt：

本发明涉及的重组载体PCB309-pfgrt，其碱基序列为SEQ ID NO.21。

本发明的另外一方面在于，提供一种转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌。

对于上文所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，较优的情况下，根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105。

对于上文所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，其制备方法包括：

(a)将重组载体PCB309-pfgrt采用电击的方法转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞；再用含有抗生素Kan50mg/ml和利福平25mg/的LB培养基筛选阳性克隆；

(b)用引物SEQ ID NO.9和10对步骤（a）筛选的阳性克隆进行PCR鉴定。

对于上文所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，其步骤（b）中所述的PCR鉴定条件为：94℃预变性1min；94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃10min。