[发明专利]一种从土壤中分离尖孢镰刀菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种尖孢镰刀菌的分离方法，尤其是一种从发生百合枯萎病的土壤中分离尖孢镰刀菌的方法，属于生物技术领域。

背景技术

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schlechtend Fr.)是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围广泛，可引起100多种植物维管束萎蔫的病害。该菌也能引起百合的种球基盘腐烂，是百合生产过程中发生最严重的病害之一，全世界百合种植区均有感染和为害的报道。该菌主要危害百合种球基部和鳞片，发病后球根基盘或鳞片上产生褐色坏死或腐烂，造成鳞片散落。从病鳞茎长出的植株明显矮化，叶片发黄或变紫，花茎少而小，严重时整株枯萎死亡。

百合贮运过程中病害可持续危害，导致大量鳞茎腐烂，造成严重损失。在我国，百合枯萎病是一种历史性病害，在云南、广州、甘肃等主要百合种植地均有发生危害的报道。近年来由于百合种植面积不断扩大，加之镰刀菌引起的枯萎病是种传病害，可随种球交易发生大规模传播，百合枯萎病有逐年加重的趋势。随着云南切花百合栽培面积的不断扩大，昆明、玉溪等百合主要种植地枯萎病的发生日趋严重，成为制约切花百合品质提高的重要因素之一。尖孢镰刀菌是一类既可侵染植物，也可在土壤中生存的兼性寄生真菌。已经发病的土壤，如果继续连作，就会年年发病，轻则减产，重则失收，给花农带来重大的经济损失。

要控制该病菌的危害，首先必须分离出病菌，对其生物学特性进行研究，以便建立较好的防治措施。对于尖孢镰刀菌的分离，现有技术大多从发病的植株中，用组织分离法进行分离。如苏世鸣等从西瓜枯萎病发病部位分离出尖孢镰刀菌；梁建根等从辣椒病株根茎处分离出尖孢镰刀菌。但是尖孢镰刀菌引起的枯萎病是一类土传病害，如何从土壤中分离该菌是预防枯萎病的关键技术之一。汪建飞等采集了滁菊连作土壤，并从中分离出尖孢镰刀菌，分离过程中采用的是镰刀菌专性选择培养基，配方较复杂；申卫收等使用了一种非无菌操作的尖孢镰刀菌分离培养基（PEA）进行平板培养计数。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从土壤中分离尖孢镰刀菌的方法，以便研究并掌握该病菌的生物学特性，最终为根除土壤中的尖孢镰刀菌提供技术支持。

本发明通过下列技术方案实现：一种从土壤中分离尖孢镰刀菌的方法，经过下列各步骤：

1）将受尖孢镰刀菌侵染的土壤研细并过20目筛，按0.01～0.02g土壤/ml琼胶液 的量，在土壤样中加入质量浓度为0.1～0.2%的琼胶液，搅拌均匀后静置至病原菌悬浮；

2）按悬浮液∶培养基=0.5～1∶25的体积比，吸取步骤1）的悬浮液置于选择性培养基上，于23～26℃、无光条件下，培养至菌丝体长出并形成菌落；所述选择性培养基如下：每升蒸馏水中含有下列组分：

磷酸二氢钾KH₂PO₄              1.0g

硫酸镁MgSO₄·7H₂O             0.5g

蛋白胨                         5.0g

琼胶                           20.0g

青霉素                         30～100 mg

链霉素                         30～50 mg

利福平                         50～200mg

五氯硝基苯                     50～150 mg；

3）按菌丝体∶培养基=0.1～0.2∶25的体积比，从步骤2）菌落中挑取菌丝体移植至新的与步骤2）相同的选择性培养基上，于23～26℃、无光条件下，培养至菌丝体长出并形成菌落，如此重复培养2～3次，得到菌落；

4）按菌丝体∶培养基=0.1～0.2∶25的体积比，从步骤3）菌落中挑取菌丝体移植至PSA培养基上，于23～26℃、无光条件下，培养2～4天，得菌落；所述PSA培养基是：每升水中含有马铃薯200g、蔗糖20g、琼胶20g；

5）在解剖镜下，从步骤4）所得菌落中选择单独的菌丝，并用毛细管从该菌丝顶端插入后，连同培养基一同切下，置于新的与步骤4）相同的PSA培养基上，于23～26℃、无光条件下，培养3～4天，得尖孢镰刀菌。

所述步骤2）的选择性培养基经过下列方法制备：

用适量氯仿溶解五氯硝基苯至完全溶解；