[发明专利]抗喹乙醇单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、其制备方法及用于检测饲料中喹乙醇的试剂盒

权利要求书

1.具有保藏号为CGMCC No.6260的小鼠脾细胞-骨髓瘤杂交瘤细胞。

2.根据权利要求1所述的具有保藏号为CGMCC No.6260的杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）制备喹乙醇衍生物—载体蛋白偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔嘁血蓝蛋白；所述喹乙醇衍生物为结构式为式（Ⅰ）的化合物

式（Ⅰ）：                                                ；

2）动物免疫：以步骤1）制备的喹乙醇衍生物—载体蛋白偶联物为免疫原免疫小鼠，取免疫后小鼠的血清，检测血清中抗喹乙醇的效价，选取效价最高的免疫小鼠；

3）细胞融合：取步骤2）得到的血清中抗喹乙醇的效价最高的免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合后培养；

4）杂交瘤细胞株的筛选：检测步骤3）得到的融合后细胞上清液的效价，筛选阳性细胞，经多次克隆后阳性率为100%的细胞即为喹乙醇特异性淋巴杂交瘤细胞株（1H9）。

3.具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体，其特征在于，是由保藏号为CGMCC No.6260的杂交瘤细胞株产生的。

4.根据权利要求3所述的具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a）腹水的制备：取成年BALB/C雌性小鼠按0.5ml/只腹腔注射液体石蜡，10天后腹腔注入权利要求1所述杂交瘤细胞株，注入量为1～5×10⁶个/只，注射10～14 天后进行无菌操作采集腹水，将采集到的腹水以转速1000 rpm离心10 min，收集中间层澄清液体，即得到腹水型单克隆抗体；

 b）抗体纯化：将步骤a）得到的离心后的腹水上清用饱和硫酸铵沉淀，获得抗喹乙醇单克隆抗体粗品；经Sephacryl S-200层析柱进行纯化分离，收集阳性管的腹水蛋白，得到抗喹乙醇单克隆抗体。

5.根据权利要求3所述的具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体在定性和定量检测饲料中喹乙醇中的应用。

6.一种利用具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体检测饲料中喹乙醇的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组成：

1）用含有喹乙醇衍生物—卵清白蛋白偶联物的包被缓冲液包被的酶标板；

2）最佳工作浓度的抗喹乙醇单克隆抗体溶液；

3）最佳工作浓度的山羊抗小鼠IgG-HRP；

4）底物A液：含体积百分含量为0.1%H₂O₂的pH 为5.0的磷酸钠柠檬酸溶液；

5）底物B液：2mg/mL的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺无水乙醇溶液；

6）终止液：2M的硫酸；

7）喹乙醇标准品溶液：分别为0、1、3、9、27、81、243ng/mL；

8）2倍浓缩样本工作溶剂：含体积百分含量0～50%甲醇，pH为7.4的PBS溶液；

9）20倍浓缩洗液：浓度为0.2M，pH为7.4的PBST溶液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒在检测喹乙醇中的应用，其特征在于，试剂盒的使用方法为：

1）样本的前处理：称取1.0 g饲料样品，研碎，加入10mL去离子水，摇匀后，放入80℃水浴40min；4000r/min离心10min，吸出上清液，滤纸过滤；用样本工作溶剂10倍或400倍稀释上清液，混合均匀，取50μL进行分析；

2）操作方法：将喹乙醇标准品溶液和待测饲料样本对应微孔编号、记录；每孔加入喹乙醇标准品溶液或待测样本各50μL，再加入喹乙醇单克隆抗体 50μL/孔，37℃反应30min；揭开盖板膜，甩干孔内液体，PBST洗涤4～5次；加入酶标二抗100μL/孔，37℃反应30min，PBST洗涤4～5次；加入底物A液、底物B液各50μL/孔，37℃反应10～15min；加入终止液50μL/孔，用酶标仪测定OD_450nm。