[发明专利]抗喹乙醇单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、其制备方法及用于检测饲料中喹乙醇的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及小分子免疫化学分析与检测技术领域，具体涉及喹乙醇单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、其制备方法及用于检测饲料中喹乙醇的试剂盒。 

背景技术

喹乙醇(o-laquindox,OLA)又称喹酰胺醇,化学名称为2-羟乙基氨基甲酰-3-甲基-喹喔啉-1,4-二氧化物，具有良好的广谱抗菌效果，对大肠杆菌、沙门氏杆菌等革兰氏阴性致病菌所致的消化道疾病具有良好的疗效，并且能够促进畜禽对饲料的消化利用，提高生长速度，在动物性食品生产中发挥了一定的作用。 

大量的国内外研究报告表明：残留于动物组织中的喹乙醇是一种基因毒剂和生殖腺诱变剂,不但能使动物发生中毒或死亡,并且残留在畜产品中对人体也有较大的危害。因此, 2001年农业部发布的《饲料药物添加剂使用规范》规定，禁止喹乙醇用于家禽及水产养殖，并且只能用于低于35 kg体重的猪饲料，使用量为50 g/t饲料。近几年来,一些饲料生产企业和养殖户受经济利益驱动，违规大剂量、长期使用喹乙醇的现象仍很严重，为了确保人类安全与健康，开展饲料及饲料添加剂中喹乙醇含量检测的工作有重要意义。 

饲料中喹乙醇的检测方法主要是高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法，但此方法不仅需要昂贵的仪器设备、专业操作人员，而且操作步骤繁琐、费时。由于酶联免疫吸附方法具有特异性强、灵敏度高、简便、快速等优点，在兽药残留分析领域应用越来越多。目前国内用于检测OLA的间接竞争ELISA试剂盒多采用进口抗喹乙醇单克隆抗体，检测费用很高；国内文献和专利中也有报道选用抗OLA多克隆抗体和抗OLA单克隆抗体用于喹乙醇残留检测，但都不是十分理想，主要是由于抗体的特异性不强、线性范围小、专属性不够等问题。例如杨曙明、于洪侠关于一种检测喹乙醇的酶联免疫试剂盒的发明专利（CN1888903）选用的是喹乙醇多克隆抗体; 2009年宋春梅硕士毕业论文—喹乙醇单克隆抗体的制备及其免疫学快速检测方法的建立中抗体特异性不强、线性范围小，并且该方法主要是针对动物性食品中喹乙醇的残留检测。 

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种具有高效价及灵敏度的高特异性抗喹乙醇单克隆抗体。 

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：具有保藏号为CGMCC No.6260的杂交瘤细胞株。 

上述杂交瘤细胞株，其保藏号为：CGMCC No. 6260，分类命名为小鼠脾细胞-骨髓瘤杂交瘤细胞；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期是2012年7月4日。 

本发明的第二个目的是提供了上述具有保藏号为CGMCC No.6260的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤： 

1）制备喹乙醇衍生物—载体蛋白偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔嘁血蓝蛋白；所述喹乙醇衍生物为结构式为式（Ⅰ）的化合物；

式（Ⅰ）： ；

2）动物免疫：以步骤1）制备的喹乙醇衍生物—载体蛋白偶联物为免疫原免疫小鼠，取免疫后小鼠的血清，检测血清中抗喹乙醇的效价，选取效价最高的免疫小鼠；

3）细胞融合：取步骤2）得到的血清中抗喹乙醇的效价最高的免疫小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合后培养；

4）杂交瘤细胞株的筛选：检测步骤3）得到的融合后细胞上清液的效价，筛选阳性细胞，经多次克隆后阳性率为100%的细胞即为喹乙醇特异性淋巴杂交瘤细胞株（1H9）。

本发明的第三个目的是提供了具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No.6260的杂交瘤细胞株产生的。 

本发明的第四个目的是提供了上述具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤： 

a）腹水的制备：取成年BALB/C雌性小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL，10天后腹腔注入2×10⁶ 个上述杂交瘤细胞株，注射10～14 天后进行无菌操作采集腹水，将采集到的腹水以转速1000 rpm离心10 min，收集中间层澄清液体，即得到腹水型单克隆抗体。

b）抗体纯化：将步骤a）得到的离心后的腹水上清用饱和硫酸铵沉淀，获得抗喹乙醇单克隆抗体粗品；经Sephacryl S-200层析柱进行纯化分离，收集阳性管的腹水蛋白，得到抗喹乙醇单克隆抗体。 

本发明的第五个目的是提供了上述具有高特异性的抗喹乙醇单克隆抗体在定性和定量检测饲料中喹乙醇中的应用。