[发明专利]一种快速提取荷花花瓣总RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域中提取总RNA（Ribonucleic Acid，核糖核酸）的方法，尤其涉及一种快速提取荷花花瓣总RNA的方法；具体地说，是以一种次级代谢产物含量高的荷花花瓣为材料，快速、经济和有效地提取高质量的总RNA的方法。

背景技术

荷花（Nelumbo nucifera），又称莲花，水芙蓉等，属睡莲科多年生水生草本花卉。荷花在我国已有近3000年的栽培历史，是一种集观赏、食用和药用于一身的重要经济作物。目前对荷花在分子生物学方面的研究还很缺乏，主要集中于分子标记研究品种多态性，一些功能基因的克隆等方面。目前，迫切需要一种有效地提取荷花花瓣的总RNA的方法，为深层地研究与花的发育、花的香气形成、花瓣中与次级代谢物合成以及荷花感光感温等相关的功能基因的研究奠定基础，进而用于培育荷花新品种。

商业化的Trizol（试剂盒）虽然能简单快速地提取植物总RNA，但是无法有效地提取荷花花瓣的总RNA，分析可能是由于RNA被多糖多酚物质吸附不能得到有效的沉淀所致。有报道利用改良的CTAB-LiCl法提取荷花花瓣的总RNA（杨峰，李创等，2009）, 但是所用试剂繁多，而且耗时也很长，增大了提取过程中RNA降解的可能性，实际使用效果欠佳。虽然快速提取植物总RNA的试剂盒采用吸附核酸的树脂或膜，但经实践证明，依然不能解决上述问题，同时存在步骤多和效率低的问题。因此，迫切需要一种简单快速且经济的提取荷花花瓣总RNA的方法以便用于后续的分子生物学实验的研究。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速提取荷花花瓣总RNA的方法。

本发明的目的是这样实现的：

包括提取RNA用具的处理、试剂的配置以及提取的具体步骤。

具体地说：

1、提取RNA用具的处理和试剂的配置

研钵、研杵和药勺用纸包好置于160 ^oC烘箱烘烤6个小时，枪头和1.5ml

的离心管用的是RNase free的Axygen公司产品（美国）；所有用到水配制的试剂都是用DEPC处理水（即0.1%的DEPC水37 ^oC处理12小时后，再经121^oC高温灭菌20min备用）。

2、具体步骤

①称取0.2g荷花花瓣于液氮预冷的研钵中迅速充分地研磨成粉末状；

②将粉末状样品转入1.5mL RNase free的离心管中，加入1mL 65^oC预热的细胞裂解液，混匀后继续65^oC温育10min，期间摇匀2～3次； 

③加入300μL的乙酸钾溶液，上下温和颠倒混匀15～20次，室温静置3～5min；

④4^oC，12000rpm，离心5min，取上清于一新的离心管中；

⑤加入300μL氯仿：异戊醇=24：1（V：V），震荡15s，4^oC，12000rpm，离心30s使分层，取上层水相于一新的离心管中，重复此步骤1～2次；

⑥加入与上层水相等体积的-20^oC预冷的异丙醇，置于-20^oC冰箱30min；

⑦在4^oC、12000rpm的条件下，离心5min使RNA沉淀；

⑧移去上清，用1mL的-20 ^oC预冷的75%乙醇洗涤沉淀两次，在超净工作台内吹干后，加入10～20μL的DEPC（焦炭酸二乙酯）处理水溶解RNA，于-80 ^oC保存。

本发明的工作原理如下：

细胞裂解液中的SDS（Sodium Dodecyl Sulfonate，十二烷基磺酸钠）能破坏细胞膜，进而迅速抑制细胞内的RNA酶，从而保证释放出来的RNA的完整性。EDTA（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸）是一种金属离子螯合剂，也能抑制需要金属离子辅助的RNA酶的活性。而PVP（Polyvinyl Pyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮）和β-巯基乙醇都是还原剂，防止酚类物质被氧化而和RNA结合。