[发明专利]OPN关联蛋白pro-MMP-9基因的克隆及表达

权利要求书

1.一种OPN关联蛋白基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，该方法包含：重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建、重组表达质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的构建和pro-MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定。

2.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建具体分为以下步骤：

1）.pro-MMP-9的引物设计：

以pET28a(+)-pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9，设计出4条引物pro-MMP-9p1、pro-MMP-9p2、pro-MMP-9p1-G-3’、 pro-MMP-9p2-G-5’，

上游引物pro-MMP-9p1含有内切酶位点Nde I，下游引物pro-MMP-9p2含有内切酶位点Hind III，

pro-MMP-9p1：5’-CGCATATGGCCATGGTGTACTGAG-3’ 

pro-MMP-9p1-G-3’：5’-GTATCATAATGCTCCGGATACATTAGA-3’

pro-MMP-9p2-G-5’：5’-AGCCTGATGAAACTCGCAATTCTGTA-3’   

 pro-MMP-9p2：5’-CGAAGCTTTGCGATGATAGATGTCACAC-3’；

2）.拼接PCR扩增pro-MMP-9基因片段

以pET28a(+)-pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9基因片段，先扩增Nde I 与pro-MMP-9基因第66碱基中间的片段和pro-MMP-9基因第54-285位碱基序列，上述PCR产物用凝胶电泳，切胶后用胶回收试剂盒回收目的片段，再拼接PCR扩增Nde I-mE7序列；

3）.TA克隆连接与转化

取pMD18-T载体，加入延伸过A的pro-MMP-9片段，再加入连接缓冲液，连接；

将上述TA连接产物转移到DH5α感受态细胞中转化，即得TA阳性克隆。

3.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，重组表达质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的构建具体分为以下步骤：

1）.酶切与回收目标片段：pro-MMP-9基因序列中有EcoR I酶切位点，用EcoR I/Hind III双酶切TA- pro-MMP-9及pET-28a(+)质粒，然后回收目标片段；

2）.T4 DNA连接酶连接及转化：在连接体系中连接过夜，然后将连接产物转入DH5α感受态，培养过夜即得阳性克隆。

4.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，pro-MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定具体分为以下步骤：

1）.重组质粒转化大肠杆菌：将上述鉴定为阳性的重组质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9转入感受态Rosetta，涂布于LB－Kan⁺平板上，培养过夜；

2）.IPTG诱导蛋白表达：挑单克隆于LB－Kan⁺中，培养过夜，然后接过夜菌于LB－Kan⁺中，继续培养，然后加入IPTG诱导蛋白表达。

5.根据权利要求1～4 中任一项所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，所述的方法中还包括pro-MMP-9蛋白的纯化和鉴定：

1）.细菌蛋白表达形式的分析：-80℃冻存菌体:加入细菌裂解液，超声破菌后离心，包涵体沉淀在底部，分别取上清、包涵体做SDS-PAGE，结果显示pro-MMP-9蛋白主要存在于包涵体中；

2）.pro-MMP-9蛋白的纯化：超声破菌后，离心弃上清，沉淀超声洗涤，将溶解有包涵体的溶液离心，取上清上样至预先平衡好的镍柱，分别用溶液洗涤10个柱床体积，再用洗脱缓冲液洗脱，收集蛋白液，充分透析，离心取上清液，收获的蛋白用SDS-PAGE进行纯度分析；

3）.pro-MMP-9蛋白的鉴定：SDS-PAGE电泳结束后取下凝胶，电转到硝酸纤维素膜上，取膜，于室温用5%脱脂奶粉封闭，加入鼠抗人pro-MMP-9抗体，室温孵育，用PBST洗膜，加入羊抗鼠抗体室温孵育，再用PBST洗膜，加入底物液显色，在暗室内显影、定影，即得目标条带。