[发明专利]OPN关联蛋白pro-MMP-9基因的克隆及表达

说明书

技术领域

本发明属于基因克隆表达技术领域，具体涉及一种OPN下游关联蛋白基质金属蛋白酶9酶原基因的克隆及表达的方法。

背景技术

胰腺癌是一种恶性程度很高的肿瘤。在我国，胰腺癌发病率呈逐步上升趋势，是导致人口死亡的十大恶性肿瘤之一，未经治疗者一年生存率大约20%，5年生存率不到4%。侵袭（invasion）和转移（metastasis）是目前胰腺癌患者治疗失败的主要原因。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种具有多种功能分泌型钙结合磷酸化糖蛋白。近年研究发现，OPN在胰腺癌肿瘤细胞中呈高表达，并与胰腺癌的侵袭和转移密切相关。因此，对其作用机制及信号通路的研究也显得极为重要。

基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases 9，MMP-9）是金属蛋白酶家族的重要成员之一，具有多种生物学功能：降解基底膜和细胞外基质，激活生长因子，促进细胞迁移。多种文献报道^{（1）（2）}，基质金属蛋白酶-9在肿瘤细胞中高表达，与肿瘤迁移密切相关。基质金属蛋白酶-9通常以酶原形式存在，从胞内分泌到胞外，当酶原激活后方具有生物学功能。而最近研究显示^（3），在胰腺癌中，OPN可能通过激活MMP-9而促进胰腺癌的侵袭和转移。因此，基质金属蛋白酶-9酶原(pro-matrix metalloproteinases 9,pro-MMP-9)的研究显得非常关键。

基质金属蛋白酶-9酶原作为分泌型蛋白，在细胞外作用，含量极少，从生物体中直接纯化得率低，操作繁琐，成本也高，不能满足工业化生产的需要。

参考文献：

1.Hema Rangaswami, Anuradha Bulbule, and Gopal C. Kundu.   Nuclear Factor-inducing Kinase Plays a Crucial Role in Osteopontin-induced MAPK/IκBα Kinase-dependent Nuclear Factor κB-mediated Promatrix Metalloproteinase-9 Activation.   (2004) J. Biol. Chem. 279：38921–35

2.Durlik M, Gardian K  Metalloproteinase 2 and 9 activity in the development of pancreatic cancer.  (2012) Pol Przegl Chir. 84:377-82.

3. Collins AL, Rock J, Malhotra L, Frankel WL, Bloomston M. Osteopontin expression is associated with improved survival in patients with pancreatic adenocarcinoma. （2012）Ann Surg Oncol. 19:2673-8.

发明内容

本发明提供一种克隆、表达并分离纯化OPN关联蛋白基质金属蛋白酶-9酶原（pro-MMP-9）蛋白质的方法，该方法包含：重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建、重组表达质粒pET-28a(+)-pro-MMP-9的构建和pro-MMP-9蛋白的诱导表达与鉴定。

进一步地，所述的基质金属蛋白酶-9酶原的克隆、表达与蛋白纯化方法中，重组克隆载体TA-pro-MMP-9的构建具体分为以下步骤：

1）.pro-MMP-9的引物设计：

以pET28a(+)-pro-MMP-9为模板，通过拼接PCR扩增pro-MMP-9，设计出4条引物pro-MMP-9p1、pro-MMP-9p2、pro-MMP-9p1-G-3’、 pro-MMP-9p2-G-5’，

上游引物pro-MMP-9p1含有内切酶位点Nde I，下游引物pro-MMP-9p2含有内切酶位点Hind III，

pro-MMP-9p1：5’-CGCATATGGCCATGGTGTACTGAG-3’   

pro-MMP-9p1-G-3’：5’-GTATCATAATGCTCCGGATACATTAGA-3’

pro-MMP-9p2-G-5’：5’-AGCCTGATGAAACTCGCAATTCTGTA-3’