[发明专利]一种苯丙氨酸定量检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及疾病诊断技术领域，特别涉及一种苯丙氨酸定量检测试剂盒以及使用该试剂盒进行苯丙氨酸定量检测的方法。

背景技术

苯丙酮尿症主要由肝脏内苯丙氨酸羟化酶或其辅助因子四氢生物蝶呤缺乏或活性降低引起苯丙氨酸不能被正常代谢为酪氨酸，导致大量的苯丙胺及其旁路代谢产物在体内堆积，对患者神经系统造成不可逆损伤，引起智力发育迟缓、肤色异常、小头畸形、语言障碍、癫痫等症状的最常见先天性氨基酸代谢异常疾病。正常人正常摄入蛋白后，血液中苯丙氨酸水平一般为0.6~2mg/dL(36~120μmol/L)，而苯丙酮尿症患者正常摄入蛋白后，由于病情严重程度不同，根据血液中苯丙氨酸含量可将苯丙酮尿症分为经典苯丙酮尿症(血液苯丙氨酸浓度超过20mg/dL或1200μmol/L)、非经典苯丙酮尿症(血液中苯丙氨酸浓度在6~20mg/dL或600~1200μmol/L)和轻型HPA(血液中苯丙氨酸在2~6mg/dL或120~600μmol/L)。

世界范围内苯丙酮尿症的平均发病率为1∶12,000，我国自1985年至2006年期间，共对13,666,750位新生儿进行了苯丙酮尿症筛查，共检出苯丙酮尿症患儿1,170例，新生儿苯丙酮尿症的发病率为1:11,680。通过及时诊断，并采取有效治疗方法，比如低苯丙氨酸饮食控制，能使苯丙酮尿症患者保持正常生理和智力发育，防止损伤的发生，因此苯丙酮尿症的早期准确诊断在苯丙酮尿症治疗中起决定性作用，我国卫生部也明确要求在全国范围内对新生儿进行苯丙酮尿症筛查。

临床上，苯丙酮尿症的诊断以及新生儿苯丙酮尿症的筛查主要通过检测血液苯丙氨酸的含量来进行，目前血液苯丙氨酸含量的检测方法主要有细菌抑制法、苯丙氨酸脱氢酶定量法、化学荧光法，这些方法都存在检测线性范围窄、灵敏度低的缺点。

发明内容

针对上述现有技术所存在的缺陷，本发明要解决的技术问题为提供一种检测线性范围宽、灵敏度高的苯丙氨酸定量检测试剂盒以及使用该定量检测试剂盒进行苯丙氨酸定量检测的方法。

具体地，本发明提供了一种苯丙氨酸的定量检测试剂盒，包括苯丙氨酸脱氢酶、辅酶β-NAD、辅酶FMN、长链脂肪醛、FMN-NADH氧化还原酶、细菌荧光素酶、0.05mol/L pH10.0的Gly-NaOH缓冲液、0.1mol/L pH7.0的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液。

上述检测试剂盒中，作为优选，所述长链脂肪醛为正葵醛。

在具体的实施例中，所述FMN-NADH氧化还原酶和细菌荧光素酶为sigma公司的含细菌荧光素酶的NAD(P)H:FMN-氧化还原酶，其货号为L8507，其工作浓度为0.5～1.0mg/ml。。

作为优选，上述检测试剂盒还包括BSA。

本发明还提供了一种苯丙氨酸的定量检测方法，包括如下步骤：

（1）使用0.05mol/L pH10.0的Gly-NaOH缓冲液配制苯丙氨酸脱氢酶溶液、辅酶β-NAD溶液，备用；

（2）向含苯丙氨酸的待测样品中加入步骤（1）所配制的辅酶β-NAD溶液、苯丙氨酸脱氢酶溶液，使苯丙氨酸发生脱氢反应生成苯丙酮酸，同时辅酶β-NAD被还原为β-NADH；该步骤为苯丙氨酸的脱氢反应，其反应方程式如图2所示；

（3）使用0.1mol/L pH7.0的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液配制辅酶FMN溶液、长链脂肪醛溶液、FMN-NADH氧化还原酶溶液、细菌荧光素酶溶液，备用；

（4）向步骤（2）所得反应混合物中加入步骤（3）所配制的辅酶FMN溶液、长链脂肪醛溶液、FMN-NADH氧化还原酶溶液和细菌荧光素酶溶液进行发光反应，3-5min内测定相对发光强度，根据校准品苯丙氨酸浓度与相对发光强度之间的线性关系，计算出样本中的苯丙氨酸含量；该步骤的发光反应过程中，β-NADH与辅酶FMN发生电子传递，并释放出490nm的蓝绿色光，该反应过程所涉及的反应方程式如图3所示。

上述方法中，作为优选，所述苯丙氨酸脱氢酶在步骤（2）所述反应体系中的终浓度为10~50mIU/L。

作为优选，所述辅酶β-NAD在步骤（2）所述反应体系中的终浓度为0.5~3mmol/L。

作为优选，所述辅酶FMN在步骤（4）所述反应体系中的终浓度为2~10μmol/L。