[发明专利]一种提高乙型脑炎病毒效价的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙型脑炎病毒增殖的方法，以及制备乙型脑炎病毒疫苗。特别涉及一种能显著提高乙型脑炎病毒效价的方法。

背景技术

流行性乙型脑炎(epidemic encephalitis B，简称为“乙脑”)又称日本脑炎(Japanese encephalitis,JE)，是由乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV,简称为“乙脑病毒”)引起的，经蚊虫传播的急性传染病。这种病可严重侵犯和感染中枢神经系统，引起临床发病而呈现神经症状。同时，该病是一种自然疫源性疾病，不仅可以感染人，还可以感染马、猪等其他动物。近年来，该病的暴发范围已由亚洲开始向澳洲等其他地区蔓延。蚊虫是乙型脑炎病毒的主要传播媒介，在目前尚无治疗乙型脑炎疾病的特效药物和方法的情况下，控制蚊虫传播和进行疫苗免疫接种是现阶段控制乙型脑炎疾病的主要防御手段。

目前，乙型脑炎疫苗主要包括三大类：经鼠脑组织培养制备的灭活疫苗、地鼠肾原代细胞或Vero细胞培养制备的灭活疫苗和地鼠肾原代细胞培养制备的减毒活疫苗。其中，应用地鼠肾原代细胞制备的乙型脑炎灭活疫苗和减毒活疫苗在乙型脑炎病的预防方面起到了重要作用。但另一方面，由于地鼠肾原代细胞在制备过程中受到了胰酶消化条件、培养条件以及病毒本身生物特性等诸多方面的影响，导致乙型脑炎病毒在增殖过程中的效价还不是很好，每批次之间的差异比较大，生产周期长，因此影响免疫原性，甚至还能导致临床免疫失败。

发明内容

为了解决以上问题，本发明的发明人通过优化乙型脑炎病毒增殖的条件、改进生产工艺而总结出乙型脑炎病毒增殖的方法及其疫苗的制备方法。通过该方法可以显著提高乙型脑炎病毒的效价，同时缩短了生产周期，并能由此制备具有更高、更稳定、免疫原性更好的乙型脑炎疫苗。

根据本发明的乙型脑炎病毒增殖的方法，该方法包括培养细胞后，向长满单层的细胞接种乙型脑炎种毒，其中，接种后，待细胞病变达到75-95%时直接收获病毒液。

根据本发明，所接种的乙型脑炎种毒是细胞维持液量的0.5-1体积%。

根据本发明，所述细胞为地鼠肾细胞，所述培养细胞的方法包括对采集到的地鼠肾组织进行胰酶消化，分离细胞移入培养液后进行转动培养；所述胰酶消化包括向采集到的地鼠肾组织中加入胰酶后，置于6-12℃下消化9-12小时。

根据本发明，所加入的胰酶与地鼠肾组织的体积比为2-3.5：1，进行胰酶消化的温度为8-10℃，时间为9.5-10.5小时。

根据本发明，进行胰酶消化前，用7-8质量%NaHCO₃将胰酶的PH调节为7.2—7.4。

根据本发明，进行培养的温度为35.5-38.5℃，进行培养的细胞浓度为1.8-2.5×10⁸个/L的细胞数量。

根据本发明，所述培养液为含10%犊牛血清和100单位/ml的双抗的乳汉液。

根据本发明，所述培养液还含有RPMI1640，且乳汉液与RPMI1640的体积比为1：0.8-1.2。

本发明还提供了一种制备乙型脑炎疫苗的方法，该方法包括用乙型脑炎病毒进行配苗，其中，该乙型脑炎病毒由根据本发明的对乙型脑炎病毒进行增殖的方法制得。

根据本发明的方法，所述乙型脑炎疫苗为灭活疫苗和/或减毒活疫苗。

具体实施方式

本发明提供了一种乙型脑炎病毒增殖的方法，该方法包括向已长满单层的细胞接种乙型脑炎种毒，其中，接种后，待细胞病变达到75-95%时直接收获病毒液。

常规的对乙型脑炎病毒进行增殖的过程中，接种了乙型脑炎种毒的细胞病变达到一定程度后，还需要经过至少一次冻融操作后再收获病毒液。这是因为，一般理论均认为必须通过反复的冻融才能使细胞破碎释放出病毒离子，病毒效价得已提高，由此可制备出高品质的疫苗。而本发明人发现，根据本发明的方法不经过冻融直接收获得到的病毒液反而具有更高的效价，并能制备出均一、稳定、免疫原性好的乙型脑炎疫苗。

根据本发明，所述细胞优选为地鼠肾细胞，所述培养细胞的方法包括对采集到的地鼠肾组织进行胰酶消化，分离细胞移入培养液后进行转动培养。