[发明专利]一种水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法

权利要求书

1.一种水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法,其特征在于，该应用方法包括：（1）基因克隆，（2）载体构建，（3）转基因，（4）通过转基因技术分析OsICE2的抗冷表型；（5）转基因植株与对照植株在抗冷生理方面的比较分析；（6）转基因植株与对照植株在低温胁迫下的蛋白质表达的变化。 

2.如权利要求1所述的水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法，其特征在于，基因克隆方法为： 

在水稻材料日本晴幼苗植株的叶片cDNA中，根据如下引物序列，通过PCR扩增到一个编码完整蛋白质序列的基因，与在核酸序列上与OsICE1有78%相似性；引物序列为： 

ICE2-F:5'–GAGGTTGCCATGGACGAG-3' 

ICE2-R:5'–CGAGCCTCATCTCATCAGT-3' 。

3.如权利要求1所述的水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法，其特征在于，载体构建方法包括： 

表达载体pUbi-OsICE2的构建方法为：根据水稻OsICE2基因的cDNA序列，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsICE2阅读框，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamHI，引物序列为： 

Over ICE2-F:5'–CTGAGGATCC GAGGTTGCCATGGACGAG-3'BamHI 

Over ICE2-R:5'–GTCAGGATCC CGAGCCTCATCTCATCAGT-3' BamHI。 

4.如权利要求1所述的水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法，其特征在于，转基因包括： 

通过电击法将pUbi-Os ICE2质粒转化至农杆菌LBA4404的感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和链霉素均为50μg·mL^-1的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经BamHl酶切验证无误后，茵液加入等体积30%甘油于-70℃保存，转基因备用； 

取水稻材料日本晴花后15d的幼胚,用75%乙醇浸泡l min,再用25%的次氯酸钠浸泡25-30min,无菌水洗3-4次,用异物针挑出幼胚,接种于诱导培养基上;将水稻愈伤组织挑出放入离心管中，取培养好的茵液lml于1.5ml离心管中，4℃，5000rpm，离心lmin，去上清，用含200μmol·L^-1乙酰丁香酮As的30ml感茵液制成悬浮液，此悬浮液倒入挑好的愈伤组织中，侵染5min，倒掉液体，将愈伤组织取出，置于无茵的含吸水纸的培养皿上沥干30-40min，将愈伤组织置于共培养培养基上，25℃暗培养60h。 

5.如权利要求1所述的水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法，其特征在于，通过转基因技术分析OsICE2的抗冷功能，具体步骤为； 

模拟冷胁迫条件，在人工气候箱内用Hogland培养液培养转基因水稻植株与非转基因水稻植株，待幼苗生长两周后于6℃下培养四天，观察到转基因植株T2-7，T2-16，T2-21的长势优于对照植株（WT）， 表现在植株高度、叶色和根长性状。 

6.如权利要求1所述的水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法，其特征在于，转基因植株与对照植株在低温胁迫下的蛋白质表达的变化的测定方法为： 

选用OsICE2转基因水稻T2-7株系和对照植株，在28℃day/25℃night,12h-light/12h-night条件下于人工气候箱中培养，两周后幼苗转入6℃冷胁迫处理12小时，取叶片冷冻于-80℃冰箱中保存； 

采用三氯乙酸/丙酮法提取幼苗叶片总蛋白，并进行蛋白定量。测定低温胁迫下OsICE2基因对蛋白质表达量的影响。