[发明专利]一种水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法。 

背景技术

冷害是一种对作物的生长发育有着重要影响的环境胁迫因子。水稻是我国的主要粮食作物，在其苗期常常遭遇冷害这一问题，从而对水稻的生产带来不利影响。因此研究作物，特别是水稻抗冷性的分子机制、培育抗性种质有着重要的理论意义和应用价值。 

按照低温的不同程度，将植物的低温伤害分为冷害和冻害，冷害是指0℃以上低温引起的植物生理机制障碍，冻害则是指0℃以下低温引起的植物生理机制障碍。植物抗冷性是其抵御低温危害的重要决定因素，抗冷力的强弱是植物长期适应与进化的结果，并受遗传因素的控制。来自于热带与亚热带地区的多数作物，比如水稻、玉米与蕃茄，对于冷害都十分敏感。但是不断增加的证据表明，作物对冷害或冻害的耐受是一系列抗逆性相关基因或蛋白转录活化的结果。 

低温胁迫激活了植物体内基因表达的网络系统，其中许多受冷诱导的早期响应因子是转录因子，这些转录因子继而激活下游更多基因 的转录，从而表现出对低温胁迫的耐受或敏感性。ICE(inducers of CBF expression)编码一个bHLH（basic helix-loop-helix）类型的转录因子,其在拟南芥等植物抗冷过程中发挥着重要的作用。ICE在拟南芥中有两个同分异构体，其中关于AtICEl的功能在拟南芥中研究的比较多。而关于水稻OsICE2基因的克隆及其功能尚未见报道，其在水稻冷害适应中的作用还不清楚。 

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法，旨在解决水稻抗冷性的基因工程问题。 

本发明实施例是这样实现的，一种水稻OsICE2基因的抗冷基因工程应用方法,该应用方法包括：（1）基因克隆，（2）载体构建，（3）转基因，（4）通过转基因技术分析OsICE2的抗冷表型；（5）转基因植株与对照植株在抗冷生理、蛋白质表达方面的比较分析。 

进一步，基因克隆方法为： 

在水稻材料日本晴幼苗植株的叶片cDNA中，根据如下引物序列，通过PCR扩增到一个编码完整蛋白质序列的基因，与在核酸序列上与OsICE1有78%相似性；引物序列为： 

ICE2-F:5'–GAGGTTGCCATGGACGAG-3' 

ICE2-R:5'–CGAGCCTCATCTCATCAGT-3' 

进一步，载体构建方法包括： 

表达载体pUbi-OsICE2的构建方法为：根据水稻OsICE2基因的 cDNA序列，设计PCR引物，其PCR产物包含完整的OsICE2阅读框，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamHI，引物序列为： 

Over ICE2-F:5'–CTGAGGATCCGAGGTTGCCATGGACGAG-3'BamHI 

Over ICE2-R:5'–GTCAGGATCC CGAGCCTCATCTCATCAGT-3'BamHI。 

进一步，转基因包括： 

通过电击法将pUbi-Os ICE2质粒转化至农杆菌LBA4404的感受态细胞中，涂在含有卡那霉素和链霉素均为50μg·mL^-1的YEP固体培养基上生长48h后，挑取阳性菌落，提取质粒，经BamHl酶切验证无误后，茵液加入等体积30%甘油于-70℃保存，转基因备用。 

取水稻材料日本晴花后15d的幼胚,用75%乙醇浸泡l min,再用25%的次氯酸钠浸泡25-30min,无菌水洗3-4次,用异物针挑出幼胚,接种于诱导培养基上;将水稻愈伤组织挑出放入离心管中，取培养好的茵液lml于1.5ml离心管中，4℃，5000rpm，离心lmin，去上清，用含200μmol·L^-1乙酰丁香酮As的30ml感茵液制成悬浮液，此悬浮液倒入挑好的愈伤组织中，侵染5min，倒掉液体，将愈伤组织取出，置于无茵的含吸水纸的培养皿上沥干30-40min，将愈伤组织置于共培养培养基上，25℃暗培养60h。 

进一步，通过转基因技术分析OsICE2的抗冷功能，具体步骤为； 

模拟冷胁迫条件，在人工气候箱内用Hogland培养液培养转基因 水稻植株与非转基因水稻植株，待幼苗生长两周后于6℃下培养四天，观察到转基因植株T2-7，T2-16，T2-21的长势优于对照植株（WT），表现在植株高度、叶色和根长性状。