[发明专利]一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法

权利要求书

1.一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法,其特征在于：包括如下步骤：

S1、构建表达质粒pcDNA3.1-hGFRα1，然后用转染法制备稳定表达hGFRα1的HEK293细胞；

S2、构建表达质粒pcDNA3.1-hRET，然后以步骤S1中制备的稳定表达hGFRα1的HEK293细胞为基础，用转染法制备能够同时稳定表达hGFRα1和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞；

S3、将待测rhGDNF加入到步骤S2得到的同时稳定表达hGFRα1和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞中，培养后测定荧光强度F1；同时设置没有加入所述待测rhGDNF的空白对照组，培养后测定荧光强度F2；

S4、将F1、F2进行比较，若F1＞F2，则说明待测的rhGDNF具有活性；若F1≤F2，则说明待测的rhGDNF不具有活性。

2.如权利要求1所述的一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法，其特征在于：步骤S1中，以pcDNA3.1-为表达载体，利用限制内切酶XhoI和Not I将载体线性化，再用T4DNA连接酶将hGFRα1cDNA连接至pcDNA3.1中，构建表达质粒pcDNA3.1-hGFRα1。

3.如权利要求2所述的一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法，其特征在于：步骤S1中，转染法的详细步骤为：

A、把2μg pcDNA3.1-hGFRα1加入到110μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

B、加15μl的Lipofectamine至150μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

C、将步骤A和步骤B的液体混合，得到DNA-Lipofectamine混合物；

D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine在室温放置30分钟；

E、然后加320μl Opti-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀备用；

F、用2ml Opti-MEM培养基洗HEK293细胞一次，然后取500μl步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到HEK293细胞中；

G、在37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中培养5小时,然后去掉上清液，留下贴壁生长的HEK293细胞，换上新鲜配置的3ml DMEM培养液，且所述DMEM培养液中含体积百分比为10%的胎牛血清、以及总重为1wt%的青霉素、链霉素、谷氨酸、非必需氨基酸，在37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中培养24小时；

H、当细胞在培养皿底部的覆盖率达到80%后，用生理盐水清洗细胞，并加入新鲜配制的含G418的选择性DMEM培养基对已转染的细胞基因组中插入了hGFRα1基因的阳性细胞进行筛选，所述选择性DMEM培养基中含体积百分比为10%的胎牛血清、总重为1wt%的青霉素、链霉素、谷氨酸和非必需氨基酸，以及500μg/ml的G418；两周后，得到稳定表达hGFRα1的HEK293细胞。

4.如权利要求1所述的一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法，其特征在于：步骤S2中，以pcDNA3.1-为表达载体，利用限制内切酶XhoI和Not I将载体线性化，再用T4DNA连接酶将hRET cDNA连接至pcDNA3.1-载体中，构建表达质粒为pcDNA3.1-hRET。