[发明专利]一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法。

背景技术

帕金森病，由Parkinson(1817)首先描述，是一种常见的中老年人神经系统变性疾病，帕金森病是老年人中第四位最常见的神经变性疾病，在≥65岁的人群中，1%患有此病，在＞40岁的人群中则为0.4%，本病也可在儿童期或青春期发病。白种人发病率最高，其次是黄种人。PD是一终身性疾病，迄今为止尚无根治的方法一旦患病则需要终身治疗，由于手术治疗价格昂贵而且有严格的手术指征，而基因治疗和干细胞治疗尚处于研究阶段，因而药物治疗仍是目前治疗PD的主要方法。

胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)的神经营养作用主要是通过其两类受体亚基介导，即胶质细胞源性神经营养因子受体alpha(GFRots)亚基和受体酪氨酸激酶Ret亚基。GFRots亚基靠其C端的磷酯酰肌醇键(GPI)锚定在细胞膜的外表面，属膜外蛋白，不能直接转导信号。GDNF首先与GFRαl受体结合形成GDNF-GFRotl复合物，此复合物再与Ret结合形成三聚体复合物，引起Ret的二聚化，并引起酪氨酸残基自磷酸化，从而引起下游的信号转导，发挥GDNF的生理作用。

体内外的许多实验研究均证明GDNF可以促进中脑黑质多巴胺能神经元，颅神经和脊髓运动神经元,脑干的去甲肾上腺素能神经元,基底前脑胆碱能神经元,背根神经节,交感神经元的存活。GDNF在这些不同环境中的表达对于其在神经变性性疾病研究及治疗有着重要的意义。直接将GDNF注入脑内到PD动物模型的黑质纹状体系统内,可改善这些模型动物的行为学症状及其黑质纹状体系统多巴胺能神经元的存活率。所以，GDNF以PD为适应症，潜在的治疗对象还包括坐骨性神经痛、周围神经损伤后造成的慢性神经痛、其它神经退行性疾病以及男性生殖干细胞疾病，因此具有广泛的社会效益和巨大的经济效益。

但是目前并没有一种能够有效的对重组人胶质细胞源性神经营养因子（rhGDNF）活性进行检测的细胞学方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法，从而消除上述背景技术中缺陷。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种测定重组人胶质细胞源性神经营养因子活性的细胞学方法,包括如下步骤：

S1、构建表达质粒pcDNA3.1-hGFRα1，然后用转染法制备稳定表达hGFRα1的HEK293细胞；

S2、构建表达质粒pcDNA3.1-hRET，然后以步骤S1中制备的稳定表达hGFRα1的HEK293细胞为基础，用转染法制备能够同时稳定表达hGFRα1和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞；

S3、将待测rhGDNF加入到步骤S2得到的同时稳定表达hGFRα1和hRET以及荧光素酶报告系统的HEK293细胞中，培养后测定荧光强度F1；同时设置没有加入所述待测rhGDNF的空白对照组，培养后测定荧光强度F2；

S4、将F1、F2进行比较，若F1＞F2，则说明待测的rhGDNF具有活性；若F1≤F2，则说明待测的rhGDNF不具有活性。

作为一种改进，步骤S1中，以pcDNA3.1-为表达载体，利用限制内切酶XhoI和Not I将载体线性化，再用T4DNA连接酶将hGFRα1cDNA连接至pcDNA3.1中，构建表达质粒pcDNA3.1-hGFRα1。

作为一种进一步的改进，步骤S1中，转染法的详细步骤为：

A、把2μg pcDNA3.1-hGFRα1加入到110μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

B、加15μl的Lipofectamine（DNA转染试剂）至150μl Opti-MEM培养基中，轻轻混匀后放置室温备用；

C、将步骤A和步骤B的液体混合，得到DNA-Lipofectamine混合物；

D、将步骤C得到的DNA-Lipofectamine在室温（25℃）放置30分钟；

E、然后加320μl Opti-MEM培养基到步骤D的DNA-Lipofectamine混合物中，轻轻混匀备用；

F、用2ml Opti-MEM培养基洗HEK293细胞一次，然后取500μl步骤E的DNA-Lipofectamine混合物，加入到HEK293细胞中；