[发明专利]一种慢病毒载体及其病毒颗粒的制备和应用

权利要求书

1.一种慢病毒载体，其特征在于，其以慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST为骨架，将慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST的BamHI和XhoI酶切位点之间的片段替换为多克隆位点片段，并且按转录方向在该多克隆位点片段的3’端插入IRES-GFP片段，所述的多克隆位点依次为：BamHI，PacI，NheI，AscI，SwaI，PmeI，所述IRES-GFP片段是以pIRES2-EGFP载体为模板，由上游引物和下游引物经过PCR扩增而制得的，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.如权利要求1所述的慢病毒载体，其特征在于，所述的多克隆位点片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种将权利要求1所述的慢病毒载体包装成慢病毒颗粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）在水中加入所述的慢病毒载体，包装质粒pLP1，pLP2和pLP/VSVG以及CaCl₂溶液，然后逐滴加入2×HBS，混匀后静置，得磷酸钙-DNA沉淀溶液；

2）再将步骤1）所得磷酸钙-DNA沉淀溶液加入到含有胰酶消化尚未贴壁的293T细胞的细胞培养基中，培养后收集病毒。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述的慢病毒载体的用量是15-20μg/1000μl，CaCl₂的用量是124mM，2×HBS的加入量是50%，所述百分比是体积百分比。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述静置为2分钟，然后立即将磷酸钙－DNA悬液逐滴加入所述的293T细胞的细胞培养基中，轻轻摇动混匀。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述的含有胰酶消化尚未贴壁的293T细胞，细胞密度为：每100mm培养皿6-8×10⁶细胞数。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述的培养为在37℃CO₂培养箱中温育，8-16小时换新鲜细胞培养基，继续培养24小时后，收集病毒。

8.如权利要求3所述的方法制备慢病毒颗粒。

9.如权利要求8所述的慢病毒颗粒在基因克隆或表达中的应用。