[发明专利]一种慢病毒载体及其病毒颗粒的制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种慢病毒载体及其病毒颗粒的制备和应用。

背景技术

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因导入载体，在现代生物医学研究中受到越来越多的关注。近年来开始应用于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加。

慢病毒系统目前市场上最有影响力的系统分别是由Invitrogen公司（近期改为Life Technologies）和Clontech公司推出的系统。Invitrogen公司的HiPerform系统包含一个表达质粒和三个包装质粒，表达质粒以pLenti6.3/V5-DEST（见图1）为代表；三个包装质粒分别为pLP1，pLP2和pLP/VSVG。采用该表达载体时，目的基因需要通过重组反应导入载体，包装时采用三个包装质粒和表达载体共转染的方法，以lipofectamine2000为转染试剂导入293T细胞（ATCC#CRL-11268），经36-48小时收获病毒颗粒。该系统在构建表达载体时，需要两种重组酶-即BP重组酶和LR重组酶，这两种酶价格昂贵，并且对温度敏感，因而重组效率常常不稳定。

Clontech公司的慢病毒系统在载体构建时虽然较为简单，但是包装过程中使用该公司研发的转染试剂，价格昂贵，很难进行规模生产。

为使慢病毒系统达到既能快速构建载体，又能以价格低廉的转染试剂进行制备，我们建立了一套慢病毒载体及病毒包装系统，克服了上述缺陷，并且取得了很好的制备病毒颗粒的效果。

发明内容

本发明目的是提供一种慢病毒载体以及将完成亚克隆的该载体包装成慢病毒颗粒的一种方法，该载体无需进行重组反应，使用酶切连接的方法可以进行亚克隆，该方法使用价格低廉的化学试剂即可完成，并且制得病毒颗粒滴度高、活性好，在侵染目的细胞中达到很好的效果。

本发明的技术方案如下：

本发明的技术方案之一是：一种慢病毒载体，其以慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST为骨架，将慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST的BamHI和XhoI酶切位点之间的片段替换为多克隆位点片段，并且按转录方向在该多克隆位点片段的3’端插入IRES-GFP片段。

其中，优选的，所述的多克隆位点（MCS）依次为：BamHI，PacI，NheI，AscI，SwaI，PmeI。

在设计多克隆位点时，充分评估了载体上其它序列信息，加上6个单一酶切位点：BamHI，PacI，NheI，AscI，SwaI，PmeI，有利于用简单的酶切、连接的方法进行克隆。优选的，所述的多克隆位点片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述IRES-GFP片段是指由内部核糖体进入位点（IRES）和绿色荧光蛋白（GFP）的编码序列组成的核苷酸片段。更优选的，所述IRES-GFP片段是以pIRES2-EGFP载体（购自Clontech公司）为模板，由上游引物和下游引物经过PCR扩增而制得的，其中上游引物的序列为如SEQ ID NO.4所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明以慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST为出发载体，插入了多克隆位点和IRES-GFP片段。慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST的BamHI和XhoI酶切位点之间的片段中含有用于重组的元件，因此，本发明将慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST的BamHI和XhoI酶切位点之间的片段替换为多克隆位点即删除了用于重组的元件。

本发明的慢病毒载体，能更高效的表达目的基因，同时又有GFP蛋白为示踪，克服了原来载体中没有GFP示踪蛋白的缺陷。

本发明的技术方案之二是：一种将所述的慢病毒载体包装成慢病毒颗粒的方法，包括以下步骤：

1）在水中加入所述的慢病毒载体，包装质粒pLP1，pLP2和pLP/VSVG（购自Invitrogen公司）以及CaCl₂溶液，然后逐滴加入2×HBS，混匀后静置，得磷酸钙-DNA沉淀溶液；

2）再将步骤1）所得磷酸钙-DNA沉淀溶液加入到含有胰酶消化尚未贴壁的293T细胞的细胞培养基中，培养后收集病毒。

优选的，步骤1）中，所述的慢病毒载体的用量是15-20μg/1000μl，CaCl₂的用量是124mM，2×HBS的加入量是50%（v/v）。