[发明专利]eIF3a突变基因及其检测引物、试剂盒、检测方法、pcβa-eIF3a-Arg803Lys突变型质粒

权利要求书

1.一种eIF3突变基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种扩增权利要求1所述突变基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物：

前引物：5’-AGATTTATTCGTAATGCGACT-3’；

后引物：5’-AGTTTCCCCTGTCTTCATCG-3’。

3.一种扩增权利要求1所述突变基因的方法，其特征在于，所述方法为：

从质粒pcβa-eIF3a的全长cDNA上扩增出突变基因并测序，pcβa-eIF3a基因序列如SEQ ID NO.7所示；扩增体系为：5×Primer star Buffer 20μL，dNTP mix8μL，前引物2μL，后引物2μL，cDNA2μL，Primer STAR 1μL，加ddH2O65μL至终体积100μL；扩增条件为：95℃预变性5min，98℃10s，58℃退火15s，72℃2min共30个循环，72℃总延伸10min；所述前引物和后引物分别为权利要求2中所述的前引物和后引物。

4.一种pcβa-eIF3a-Arg803Lys突变型质粒，其特征在于，所述质粒包括权利要求1所述的突变基因，所述质粒的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.一种制备权利要求4所述pcβa-eIF3a-Arg803Lys突变型质粒的方法，包括如下步骤：

（1）从质粒pcβa-eIF3a的全长cDNA上扩增出含2554G>A位点的DNA片段Arg803Lys；扩增引物为：

前引物：5’-AGATTTATTCGTAATGCGACT-3’；

后引物：5’-AGTTTCCCCTGTCTTCATCG-3’；

扩增体系为：5×Primer star Buffer 20μL，dNTP mix8μL，前引物2μL，后引物2μL，cDNA2μL，Primer STAR1μL，加ddH2O65μL至终体积100μL；扩增条件为：95℃预变性5min，98℃10s，58℃退火15s，72℃2min共30个循环，72℃总延伸10min；

（2）将步骤（1）的扩增的Arg803Lys用乙醇沉淀，然后在Arg803Lys末端加A尾；

（3）采用切胶法回收经步骤（2）处理的Arg803Lys；

（4）将Arg803Lys与pGEM-T easy载体连接后转化至DH5α高效率感受态细胞，于LB/氨苄平板上37℃过夜培养，再挑单克隆培养后提取质粒，然后用ApaI酶切验证连接质粒；（5）定点诱变构建pGEM-T easy-Arg803Lys突变型载体：

PCR扩增体系：10*reaction buffer 5μL，pGEM-T easy-Arg803Lys 1μg，前引物5’-GGCAGCGTAAAGAAGAACGCAAGATAACATACTATAGAGAAA-3’1μL，后引物5’-TTTTCTCTATAGTATGTTATCTTGCGTTCTTCTTTACGCTGCC-3’1μL，dNTP mix1μL，Quik Solution reagent1.5μL，ddH2O加至50μL，最后加1μL Quik change Enzyme；

热循环：96℃2min，96℃20s，60℃10s，68℃2min共20个循环。最后68℃延伸5min；

将PCR产物经DpnⅠ消化后转化至XL10-Gold超级感受态细胞，涂布LB/氨苄平板，37℃下培养后挑单克隆培养，提取质粒，即为pGEM-T easy-Arg803Lys突变型载体；

（6）分别将pGEM-T easy-Arg803Lys突变型载体和pcβa-eIF3a进行MluI和BspDI双酶切，将pcβa-eIF3a双酶切后不含2554G>A位点的DNA片段与pGEM-T easy-Arg438Cys酶切后含2554G>A位点的DNA片段进行连接，然后将连接产物用BL21感受态细胞进行转化，涂LB/氨苄平板筛选，挑单克隆LB培养基培养并提取质粒，即得pcβa-eIF3a-Arg803Lys突变型质粒。