[发明专利]生产紫杉二烯的酵母菌及构建方法无效

专利信息
申请号: 201310064250.7 申请日: 2013-02-28
公开(公告)号: CN103146729A 公开(公告)日: 2013-06-12
发明(设计)人: 元英进;贾云婧;丁明珠;闫慧芳 申请(专利权)人: 天津大学
主分类号: C12N15/60 分类号: C12N15/60;C12N9/88;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
代理公司: 天津市北洋有限责任专利代理事务所 12201 代理人: 陆艺
地址: 300072*** 国省代码: 天津;12
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摘要:
搜索关键词: 生产 紫杉 酵母菌 构建 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及一种生产紫杉二烯的酵母菌及构建方法。

背景技术

紫杉醇是一种有效的抗癌药物,传统的获得方法包括为对红豆杉进行植物提取,但红豆杉中不仅含量极低,且大量砍伐红豆杉树木为环境不友好行为;植物细胞培养的方法虽然解决了大规模砍伐红豆杉的问题,却因植物细胞生长周期较长,故获得紫杉醇的效率也并不高;化学合成法不仅合成步骤复杂,且每一步收率不高,若应用此法进行大规模生产势必产生大量污染废物,且成本昂贵。

人类健康、能源、环境等领域的重大需求也牵引着合成生物学的迅猛发展。将基因元件(启动子、转录调控区域、核糖体结合位点、开放阅读框、终止子等)依据工程化目标需要,有机重构和连接起来,便形成了功能基因模块。通过对已有生物网络加以利用,同时引入新的功能基因模块,表达出天然细胞不能合成或含量极低的产物。

美国Croteau R教授的实验室在紫杉醇生物合成的研究中作了大量的、卓有成效的工作,经过十几年的努力,紫杉醇大部分生物合成途径已经明确。紫杉二烯作为紫杉醇合成途径中的关键前体,其产量的提升具有十分重大的意义。

华盛顿州立大学的Croteau教授是最早从事紫杉醇合成途径解析和相关基因克隆工作的,从上世纪90年代开始相继克隆了紫杉醇合成的多个基因,为微生物合成紫杉醇提供了物质基础。2001年,德克萨斯州农工的Scott等在大肠杆菌中首次实现了紫杉二烯的生物合成,产量为1.3mg/l。2004年西班牙巴塞罗那大学的Boronat等在拟南芥中实现了紫杉二烯的合成,产量为600ng/g DW。2005年德国Darmstadt技术大学的Jennewein等在酵母中合成了紫杉二烯,产量达到8.7mg/L。2006年,Croteau教授等在酵母菌实现了紫杉二烯-5α-醇的合成,约为25μg/L。2010年,麻省理工学院(MIT)的Stephanopoulos课题组在大肠杆菌中成功实现了紫杉二烯的合成,产量高达1020±80mg/L。虽然在大肠杆菌中紫杉二烯的产量已经达到较高水平,但当此课题组进行后续紫杉二烯-5α-醇的合成时,却只检测到很少量的产物,这可能由于P450酶在大肠杆菌的背景下难以有效地发挥其催化功能。因此,在酵母中进行紫杉二烯及后续前体的合成具有独到的优势和重要的意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足,提供一种紫杉二烯合酶基因。

本发明的第二个目的是提供一种紫杉二烯合酶基因编码的蛋白质。

本发明的第三个目的是提供一种生产紫杉二烯的酵母菌的构建方法。

本发明的第四个目的是提供一种生产紫杉二烯的酵母菌。

本发明的技术方案概述如下:

一种紫杉二烯合酶基因,是序列表SEQ ID NO:11所述的核苷酸序列。

上述紫杉二烯合酶基因编码的蛋白质,是序列表SEQ ID NO:12所述的氨基酸序列。

一种生产紫杉二烯的酵母菌的构建方法,是包括如下步骤:

(1)载体SyBE_001175的构建:

①将启动子、GGPP合酶基因(crtE)、终止子采用OE-PCR方法拼接起来,得到两端包含HindⅢ和ApaⅠ位点的片段,连接入游离型载体pRS425;

②将启动子、序列表SEQ ID NO:11所示的紫杉二烯合酶基因、终止子采用OE-PCR方法拼接起来,得到两端包含SacⅠ和HindⅢ位点的片段,连接入步骤①获得的载体,得到载体SyBE_001175;

(2)载体SyBE_001187的构建:

①将酵母组成型启动子、tHMGR基因、终止子应用OE-PCR法拼接起来,得到两端包含XhoⅠ和ApaⅠ位点的片段,连接至整合型载体pRS403;

②将酵母组成型启动子、ERG20基因、终止子应用OE-PCR法拼接起来,得到两端包含Sac Ⅰ和XhoⅠ两个位点的片段,连接至步骤①获得的载体,得到载体SyBE_001187;

所述GGPP合酶基因是序列表SEQ ID NO:9所述的核苷酸序列;所述tHMGR基因是序列表SEQ ID NO:3所述的核苷酸序列;所述ERG20基因是序列表SEQ ID NO:7所述的核苷酸序列;

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