[发明专利]产共轭亚油酸的食品级重组乳酸乳球菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及产共轭亚油酸的食品级重组乳酸乳球菌及其构建方法与应用。

背景技术

共轭亚油酸（CLA）属于十八碳二烯酸，是亚油酸（LA）的异构体，包括二十余种组分。其中对顺式-9，反式-11共轭亚油酸和反式-10，顺式-12共轭亚油酸（trans-10，cis-12；t10c12-CLA）异构体的生物学活性比较清楚。对t10c12-CLA来说，它能够促进身体的代谢，抑制脂肪的合成，能减少肥胖症的发生概率。2008年，美国FDA颁发食品许可证，同意将CLA作为食品添加剂使用。目前，CLA已经被许多食品和制药企业作为保健品生产并出售。

自然界中，牛、羊体内的一些瘤胃微生物有合成CLA的能力，这些CLA能够进入乳汁中，一升牛奶的CLA总量在1.4克左右，其中t10c12-CLA的比重小于10%。工业上，将亚油酸碱性异构化后生成CLA，产物是混合物的形式，除了上述两种CLA组分外，还含有多种异构体杂质，杂质的含量甚至能达到30%以上，这些杂质如果进入人体，容易通过花生四烯酸代谢途径衍生出多种有负面生物学效应的共轭类异构体。可以看出，如果食品中添加的CLA不含有杂质、成分单一的话，更有利于消费者的健康。

在生物技术的支撑下，利用微生物大量生产CLA的单一组分，是一个比较理想的途径。研究发现，自然界的一些低等菌类具有自身合成t10c12-CLA组分的能力，例如，痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶PAI（Propionibacterium acnes isoenzyme）就能够将亚油酸LA异构成t10c12-CLA。密码子优化的pai基因，能够在哺乳类细胞中异源表达，也可以将亚油酸转化成t10c12-CLA成分（苟克勉，李世丽，亚油酸异构酶在脱氢和异构方面的双重用途，专利申请号：201110112685.5）。但目前还未有t10c12-CLA转化效率高的重组食品级微生物的报道。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供t10c12-CLA转化效率高的重组乳酸乳球菌及其构建方法与应用。

本发明所提供的一株t10c12-CLA转化效率高的重组乳酸乳球菌，是乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）PAI-75，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.7148。

本发明所提供的构建t10c12-CLA的转化效率高重组乳酸乳球菌的方法，包括将蛋白质PAI的编码基因导入作为宿主菌的乳酸乳球菌中得到反式-10，顺式-12共轭亚油酸的转化效率高于所述宿主菌的重组乳酸乳球菌的步骤；

所述蛋白质PAI为如下a）或b）的蛋白质：

a）由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）将SEQ ID No.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有亚油酸异构酶活性，或具有亚油酸异构酶活性由a）衍生的蛋白质。

其中，所述蛋白质PAI具有亚油酸异构酶活性。SEQ ID No.2由424个氨基酸残基组成。

上述方法中，所述t10c12-CLA的转化效率是指所述宿主菌或重组乳酸乳球菌以亚油酸为底物，培养得到的菌体中的反式-10，顺式-12共轭亚油酸的质量与菌体中反式-10，顺式-12共轭亚油酸和亚油酸质量之和的比值。

所述蛋白质PAI的编码基因具体可为如下1）或2）或3）的DNA分子：

1）其编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质PAI的DNA分子；

3）与1）限定的DNA分子具有90％以上的一致性且编码所述蛋白质PAI的DNA分子。

其中，SEQ ID No.1由1275个核苷酸组成，其编码序列是第1-1275位。

上述方法中，所述宿主菌为食品级乳酸乳球菌和/或其衍生菌株。

所述蛋白质PAI的编码基因通过重组食品级表达载体导入所述宿主菌中。