[发明专利]抗GFAP单克隆抗体可变区序列及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及抗GFAP单克隆抗体可变区序列及其制备方法。

背景技术

胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是一种由中央神经系统星形胶质细胞特异表达的中间纤维蛋白，在细胞间信号传导及脑血屏障功能中发挥重要作用。GFAP在细胞有丝分裂过程中表达水平提高，与有丝分裂时细胞内纤维网增多相适应。有研究表明GFAP基因敲除小鼠髓磷脂变异，脑血屏障结构功能严重损伤。

GFAP表达水平异常与多种遗传病和精神病相关，如亚历山大病、唐氏综合症、精神分裂症、情感型双极性疾患和抑郁症。此外，急性感染和神经性退行病变时，GFAP表达水平会降低。在一项研究中，运用体外肺膜治疗的22位儿童患者中，GFAP水平高的患者比GFAP水平正常的患者的死亡可能性高13倍，脑损伤的可能性高11倍。目前，GFAP表达水平已经作为中风、脑外损伤、星形细胞源性胶质瘤等多种疾病的诊断标志之一。

GFAP抗体仅识别星形胶质细胞，而不识别神经细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞以及肿瘤细胞等其它类型的细胞。因此GFAP抗体被广泛用于星形胶质细胞的免疫染色鉴定。此外，GFAP抗体已应用于ELISA法定量测定人血清、血浆、脑脊液、细胞培养上清或其它相关生物液体中GFAP含量。

免疫组化研究中发现，在正常乳腺和良性乳腺病变组织中，有部分肌上皮细胞（MEC）表达GFAP，而乳腺原位癌中残存的MEC不表达GFAP；在乳腺原位癌和侵润性癌中，各种癌细胞均不表达GFAP；在乳腺的各种良性病变中，部分上皮细胞（EC）和间质的肌纤维母细胞可以表达GFAP，但是在乳腺癌的间质中，即使间质纤维化很严重，肌纤维母细胞也不表达GFAP。GFAP的免疫组化染色有助于癌细胞与良性增生的上皮细胞和肌上皮细胞的鉴别，而且在小管癌中有助于癌性小管（阴性）和良性增生性小管（阳性）的鉴别。

发明内容

如上所述，对GFAP在生物技术和医药病理等方面的的分析研究越来越多，基于这一背景，本发明的目的是构建抗GFAP单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列和轻链可变区的核苷酸序列，同时提供制备上述核苷酸序列的方法。

为实现上述目的，本发明用GFAP蛋白作为抗原，免疫小鼠后，经检测得到相应抗体表达呈阳性的小鼠，取表达呈阳性小鼠的脾脏，分离脾细胞后，融合脾细胞和骨髓瘤细胞，在HAT培养基中培养后，检测得到抗体表达阳性克隆，提取阳性杂交瘤细胞总RNA，以总RNA中的mRNA为模板，反转录得到相应抗体基因的cDNA，再通过PCR扩增获得相应抗体重链可变区和轻链可变区，由此实现本发明。

本发明提供了下述各项：

抗GFAP单克隆抗体可变区序列，包含两种核苷酸序列，所述核苷酸序列分别为CM10330-VH和CM10330-VL。

优选地，所述核苷酸序列CM10330-VH和CM10330-VL由保藏号为180CT3.1.5的杂交瘤细胞株制备而成。

优选地，所述CM10330-VH编码114个氨基酸，分子量为12651D，其中CDR1、CDR2和CDR3的区域相应地分别为26aa-33aa，51aa-58aa和97aa-103aa。

优选地，所述CM10330-VL编码108个氨基酸，分子量为12101D，其中CDR1、CDR2和CDR3的区域相应地分别为27aa-32aa，50aa-52aa和89aa-97aa。

优选地，还包括与上述两种核苷酸序列具有相同氨基酸序列产物的核苷酸序列。

优选地，还包括经过一个或者几个碱基替换、缺失或添加后仍具有与所述核苷酸序列产生的氨基酸序列具有相同活性的核苷酸序列。

制备所述的抗GFAP单克隆抗体可变区序列的方法，包括以下步骤：

（1）杂交瘤细胞的制备：首先用GFAP蛋白抗原免疫雌性健康的BALB/c小鼠，挑选出免疫后抗体表达呈阳性的小鼠，取其脾脏细胞，然后将分离的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞；

（2）单克隆细胞的筛选：将上述杂交瘤细胞在HAT培养基中培养，对ELISA检测呈阳性的单克隆细胞进行ELISA复筛，然后将筛选出的ELISA阳性单克隆细胞进行WB复筛，再将WB阳性细胞进行亚克隆，经过2次亚克隆，筛选出能够稳定分泌抗体的单克隆细胞，将阳性的单克隆细胞扩大培养后定株、冻存；

（3）杂交瘤细胞抗GFAP单克隆抗体的获得：首先鉴定步骤（2）所制备的单克隆细胞的亚类亚型，然后将阳性的单克隆细胞注射到小鼠体内进行腹水生产，再将产生的腹水通过层析纯化后得到抗GFAP单克隆抗体；