[发明专利]高脂质含量葡萄藻新品系的育种方法

权利要求书

1.一种高脂质含量葡萄藻新品系的育种方法，其特征在于，该方法是：将葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖，然后置于冰水浴中，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成单细胞；单细胞化的葡萄藻经化学诱变剂甲基磺酸乙酯诱变及低熔点琼脂糖固定化培养后，利用尼罗红显微荧光活体筛检技术获得高脂质含量的葡萄藻候选突变体；再经扩大培养和脂质含量测定选育出高脂质含量的葡萄藻新品系；所述的低熔点琼脂糖是指在多糖链上引入羟乙基后的琼脂糖；所述的高脂质含量的葡萄藻是指脂质含量比其出发品系至少高30%的葡萄藻。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1) 取4 mL待测葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入微粒型黄单胞多糖，并置于冰水浴中预冷；微粒型黄单胞多糖的添加量为5粒，0.2 mg/粒，共1 mg；

(2) 预冷藻液经超声波处理10 s后，在光学显微镜下观察葡萄藻集落是否已被分散成单细胞； 

(3) 若没有，则用每次5 s的超声波进行多次处理，直至被分散成单细胞，由此计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间T=10+5×n，单位为s，其中n为每超声处理5 s的次数；

(4) 藻液经6000 rpm离心10 min，获得的藻细胞用甲基磺酸乙酯诱变处理；

(5) 6000 rpm离心10 min后，将藻细胞转入培养液中，并使其560 nm的光密度D₅₆₀为0.05；转入10 ml的PE管中，每管装4 ml，并置于37℃水浴中保温；

(6) 用低熔点琼脂糖固定细胞，并置于25℃光照培养箱中培养30 d；

(7) 将含藻细胞的低熔点琼脂糖凝胶切成1 mm厚的圆片，并置于含2%(V/V)二甲基亚砜和1 μg/mL尼罗红的染色液中于黑暗下40℃染色10 min；

同时，按上述步骤制备对照组，其中步骤(4)用于处理藻细胞的是不含甲基磺酸乙酯的0.5 M磷酸缓冲液，其pH值为7.0；

(8) 取1片染色后的对照组藻细胞的凝胶片并展到载玻片上，置于荧光显微镜上用蓝光激发，通过调节荧光显微镜上蓝色激发光电流调控旋钮调节激发光强度直至能看到具红色荧光的葡萄藻细胞，再通过调节荧光显微镜上蓝色激发光电流调控旋钮逐渐调低激发光的强度，至显微视野中藻细胞的荧光刚好消失，记下电流表上表征此时蓝色激发光强度的电流值I，继续调节蓝色激发光电流调控旋钮使电流表的电流值降至2I/3，保持此时旋钮的位置不变；

(9) 将经甲基磺酸乙酯诱变的藻细胞的凝胶片用尼罗红染色后展到载玻片上，并置于荧光显微镜上用调节好光强度的蓝光激发，当观察到具红色荧光的藻细胞时，用接种针挑取相应的凝胶块，并置于含1 ml培养液的2 ml PE管中，用频率为20 kHz、发射功率为100 W、以1 s / 1 s 的开/关间歇的超声波处理20 s以粉碎凝胶块，再置于25℃光照培养箱中培养30 d，即获得高脂质含量的葡萄藻新品系。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（2）或（3）中制备葡萄藻单细胞时，设定超声波仪的频率为20 kHz，发射功率为100 W，将Φ2型变幅杆前端2 cm浸入预冷藻液，以1 s / 1 s 的开/关间歇超声处理15~25 s。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（6）中，使用与藻液等体积的浓度为2%、65℃的低熔点琼脂糖进行固定藻细胞。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中，所述诱变处理是：将藻细胞放入浓度为3%的甲基磺酸乙酯溶液处理6 h，再避光3h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述甲基磺酸乙酯溶液以pH7.0的0.5 M磷酸缓冲液作为溶剂。