[发明专利]高脂质含量葡萄藻新品系的育种方法

说明书

技术领域

本发明属于能源微藻——葡萄藻开发利用的技术，特别涉及一种高脂质含量葡萄藻新品系的育种方法。

背景技术

葡萄藻（Botryococcus）是一种世界广布的能源微藻，该藻因脂质含量通常为其细胞干重的25-35%，普遍高于小球藻等其它微藻，且脂质的组成和结构与化石原油的也最为相近，而被誉为“油藻”，以其生产航空燃油等高品质燃料一直是近年来全球生物能源领域的研发热点之一[Metzger & Largeau. Botryococcus braunii: a rich source for hydrocarbons and related ether lipids. Appl Microbiol Biotechnol. 2005, 66: 486–496; Sakamoto, et al. Optimization of light for growth, photosynthesis, and hydrocarbon production by the colonial microalga Botryococcus braunii BOT-22. Bioresource Technology. 2012, 110: 474?479.]。种子工程是农业与生物产业的基础，选育优良种质的重要性不仅在螺旋藻、小球藻等经济微藻的产业化进程中得到了充分体现，在推进水稻、小麦、玉米等农作物高产、优质、低成本生产中更是表现得淋漓尽致。值得指出的是，有关葡萄藻优良种质选育虽已受到国内外的高度重视，但在葡萄藻遗传育种研究方面迄今近乎空白，而从自然界分离藻株的适应性差、脂质产率低等问题，也正是制约着葡萄藻至今尚未能得到商业化开发应用的主要瓶颈。因此，迫切需要运用诱发突变等现代育种技术，对从自然界分离获得的葡萄藻种进行遗传改良，显著提高其对人工培养条件的适应性、生长速率及含脂量，这对实现葡萄藻的低成本工业化培殖并以之生产品质和价格等均能与化石燃油相竞争的生物燃油，推进葡萄藻制油的产业化进程，具有重要意义。

目前，开展高脂质含量葡萄藻新品系选育主要面临着以下两方面的技术难题：1、葡萄藻呈由几十至几百个细胞聚集而成的集落状，其诱变频率及突变体筛选效率远低于小球藻等呈单细胞态的微藻；2、还没有建立适于筛选高脂质含量突变体的选择压力，只能先将藻液涂于平板分离培养，再将大量的克隆逐一接种到培养液扩大培养后再进行脂质测定，因而筛选的工作量大、效率低、成功率小。因此，迫切需要建立一种简便、高效、高通量的高脂质含量葡萄藻新品系的选育方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，建立一种高脂质含量葡萄藻新品系的育种方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种高脂质含量葡萄藻新品系的育种方法，该方法是：将葡萄藻液置于离心管，加入微粒型的黄单胞多糖，然后置于冰水浴中，并用超声波将由几十至上百个细胞形成的葡萄藻集落制备成单细胞；单细胞化的葡萄藻经化学诱变剂甲基磺酸乙酯诱变及低熔点琼脂糖（low melting agarose）固定化培养后，利用尼罗红显微荧光活体筛检技术获得高脂质含量的葡萄藻候选突变体；再经扩大培养和脂质含量测定选育出高脂质含量的葡萄藻新品系；所述的低熔点琼脂糖是指在多糖链上引入羟乙基后的琼脂糖（低熔点琼脂糖系常用的生物培养与分子操作实验素材，其熔点约为65℃，比普通琼脂糖的熔点低30℃左右）；所述的高脂质含量的葡萄藻是指脂质含量比其出发品系至少高30%的葡萄藻。

本发明具体包括以下步骤：

(1) 取4 mL待测葡萄藻液于5 mL离心管中，再加入微粒型黄单胞多糖，并置于冰水浴中预冷；微粒型黄单胞多糖的添加量为5粒，0.2 mg/粒，共1 mg；

(2) 预冷藻液经超声波处理10 s后，在光学显微镜下观察葡萄藻集落是否已被分散成单细胞； 

(3) 若没有，则用每次5 s的超声波进行多次处理，直至被分散成单细胞，由此计算被测葡萄藻液适宜的超声处理时间T=10+5×n，单位为s，其中n为每超声处理5 s的次数；

(4) 藻液经6000 rpm离心10 min，获得的藻细胞用甲基磺酸乙酯诱变处理；

(5) 6000 rpm离心10 min后，将藻细胞转入培养液中，并使其560 nm的光密度D₅₆₀为0.05；转入10 ml的PE管中，每管装4 ml，并置于37℃水浴中保温；

(6) 用低熔点琼脂糖固定细胞，并置于25℃光照培养箱中培养30 d；