[发明专利]一种适于水稻杂交种真实性鉴定的SSR指纹图谱构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术中的杂交种真实性鉴定技术，具体涉及一种适于水稻杂交种真实性快速准确鉴定的SSR指纹图谱构建方法。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，我国是世界上最大的杂交水稻种子生产国和消费国，具有庞大的杂交水稻种子市场。水稻杂交种的真实性和纯度是衡量种子质量的重要指标，直接影响农作物的产量、品质和农民的利益。快速、准确、简便、经济地鉴定杂交水稻种子真实性对育种和农业生产都具有重要意义。传统的形态鉴定法依赖于品种表型差异，而形态性状的表现受环境影响较大，且形态鉴定法工作量大、鉴定周期长、成本高、受季节限制。同工酶和种子贮藏蛋白多态性不够丰富，且同工酶有组织和器官特异性、稳定性差。

DNA分子标记技术具有多态性好、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，已开始广泛应用于作物杂交种真实性与纯度检测中。目前，应用较多的是SSR分子标记，常规SSR扩增产物分离检测技术主要有琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳及毛细管电泳技术。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中必然接触有毒的物质，如琼脂糖凝胶中的染色剂，聚丙烯酰胺凝胶中的变性剂等，毛细管电泳虽检测方便，但需要标记引物，增加了检测成本。相比之下，高分辨率熔解曲线分析具有明显优势：（1）PCR中只增加荧光染料的成本，不需设计探针，不需进行引物标记；（2）高通量，可在15min内检测一块96或者384孔板的样品；（3）操作简便，PCR结束后不需电泳和其他片段分离操作，扩增产物直接进行熔解分析；（4）检测结果准确性和稳定性较好；（5）样品可继续用于下游测序和其他检测工作。因此，高分辨率熔解曲线分析是一种高通量、快速、高灵敏度、低成本、闭管的突变与基因型检测方法（Croxford等，2008；Studer等，2009），大大减少了测序的工作量和成本，提高了核苷酸序列分析的效益。研究表明，高分辨率熔解曲线分析可以有效检测DNA水平的SNP、SSR和Indel等多种变异，技术上比其它方法更具优势。

高分辨率熔解曲线分析（High Resolution Melting Curve Analysis，HRM）是Gundry等于2003年提出的最初应用于单核苷酸多态（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）检测分析的一项新技术（Gundry等，2003）。该技术是根据碱基序列组成不同的核苷酸片段熔解温度不同这一物理性质，在聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）结束后于同一容器中直接进行高分辨率熔解，并利用饱和染料监控核苷酸片段的熔解过程，得到特征性熔解曲线，再根据熔解曲线的形态变化来判断核苷酸片段性质（片段长度、碱基序列和CG含量）的差异（Silvar等，2011）。饱和染料在DNA双链中会发出荧光，在升温过程中DNA双链解链熔解、荧光减弱，在变为单链时尤为急剧，从而形成熔解曲线，熔解曲线的形状与DNA片段长度、GC含量和碱基序列有关（Ririe等，1997）。其中，DNA熔解温度（Tm）为荧光降低50%的温度，其差别直观反映了目标DNA序列的变异（Wilhelm和Pingoud，2003）；Tm值的精确计算需要去除背景荧光（低温的线性下降和高温的指数下降），专用软件则可去除背景、产生正态化的熔解曲线。在利用高分辨率熔解曲线分析含突变位点基因时，由于突变位点不匹配会导致双链DNA在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA双链上释放，根据荧光强度与时间曲线峰形差异就可以判断是否存在突变位点，而且不同突变位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此，高分辨率熔解曲线分析能够准确而有效地区分不同突变位点与不同基因型。目前，高分辨率熔解分析的应用领域主要集中在SNP分析、突变扫描、甲基化分析、基因分型、序列匹配等医学和微生物学研究方面，近年来已成为生命科学研究中的热点技术（Tokuko等，2010）。在植物研究中，高分辨率熔解曲线分析的应用也已经逐步开展，主要用于SNP分析与做图、基因分型和种质鉴别等（Koeyer等，2010）。

常规的SSR指纹图谱构建方法大都基于SSR扩增产物的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，不适于农作物杂交种真实性简便、快速、准确鉴定。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳及毛细管电泳技术在农作物杂交种鉴定中的不足，推进SSR等共显性分子标记技术在农作物杂交种真实性鉴定上的广泛应用与推广，提供一种操作简便、检测快捷、准确可靠的适于水稻杂交种真实性鉴定的SSR指纹图谱构建方法。本发明采用的技术方案如下所述。