[发明专利]MgCl2胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及链霉菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶技术领域，具体涉及一种添加MgCl₂提高发酵法制备谷氨酰胺转氨酶的方法。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase，简称TGase，EC 2.3.2.13，R-glutaminyl- peptide：amnie-γ-glutamyl-transferase）又名转谷氨酰胺酶，它通过催化蛋白质中的谷氨酸残基上的甲酰胺与赖氨酸残基上的ε-氨基进行酰基转移反应，使蛋白质在分子内或分子间形成交联。

在二十世纪八十年代，Ikura等人报道了谷氨酰胺转氨酶对食物蛋白质的交联作用。他们用哺乳动物源谷氨酰胺转氨酶交联几种食物蛋白质，如酪蛋白、大豆蛋白等。这些蛋白的交联，提高了其产品的功能性，如凝胶性、溶解性和乳化性等。然而，由于其高昂的价格和低效的利用率限制了它在食品工业上的应用。从链霉菌中成功分离到微生物源谷氨酰胺转氨酶是促进其在食品工业上应用的一个里程碑。它使得这种酶可以大规模地生产，并且被商业利用。由于链霉菌谷氨酰胺转氨酶底物的催化特性，以及它在食品、纺织和医药行业中的广阔应用前景，受到了国内外学者的广泛关注，在亚洲的日本、台湾，欧洲的丹麦、荷兰、法国、德国、爱尔兰以及巴西等国家均投入了大量的人力、物力、财力进行研究，并取得了突飞猛进的进展。

谷氨酰胺转氨酶的来源主要有3种：一是从动物的组织或体液中提取，例如牛、猪或鱼等，由于动物组织种类有限、来源稀少、含量低、组织特异性又极高，而且分离精制过程复杂，价格十分昂贵；在欧洲，商业化的凝血因子XIII（谷氨酰胺转氨酶的一种）主要通过宰杀牛或猪等动物来获得，但由于血液中的谷氨酰胺转氨酶通常需要凝血酶激活才具有活性，故很少应用于食品工业中。二是以大肠杆菌、棒状杆菌和链霉菌等为宿主，用基因工程手段来生产此酶。基因工程菌表达效果较差，远不能达到原有水平；虽然有些报道产量较高，但某些国家对基因工程产品限制比较严格。三是直接筛选产谷氨酰胺转氨酶的微生物，通过发酵法来生产。由于此方法技术可行、成本较低、生产不受出发材料和季节限制，最有可能进行大规模生产和广泛应用。但是目前食品级谷氨酰胺转氨酶来源单一、产量较低、价格昂贵，限制了其在食品工业上的应用。

国内外提高微生物谷氨酰胺转氨酶产量的报导大多集中在优化发酵条件，改善培养基组成等方面。虽然这些研究都取得了一些成果，但是此酶的产量仍然较低。目前商业化的产品主要由日本味之素等公司生产。国内用微生物发酵法生产谷氨酰胺转氨酶尚处于起步阶段，产量较低。

发明内容

针对现有谷氨酰胺转氨酶的制备方法存在的问题，本发明提供一种MgCl₂胁迫提高茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶产量的方法。

本发明的发明目的是通过如下技术方案实现的：

采用茂原链霉菌为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中经液体发酵制备谷氨酰胺转氨酶，通过在发酵培养基中添加MgCl₂，发酵96 h，最终实现了提高谷氨酰胺转氨酶产量的目标。

具体技术方案如下：

1、菌种及培养基：

（1）菌种 ：

茂原链霉菌（Streptomyces mobaraense）DSM40587：购于日本NBRC。

（2）斜面培养基（g/L）：高氏一号培养基。

（3）种子培养基（g/L）：聚蛋白胨20，可溶性淀粉20，磷酸氢二钾2，磷酸二氢钾2，酵母粉2，无水硫酸镁2，pH 7.0。

（4）初始发酵培养基（g/L）：聚蛋白胨30，可溶性淀粉10，果糖10，磷酸氢二钾2，酵母粉2，无水硫酸镁1，pH 7.0。

2、谷氨酰胺转氨酶酶活的测定方法：

采用分光光度法37 ℃下测定。吸取50μL发酵液，加入0.5mL试剂A，37 ℃水浴保温10min，加入0.5mL试剂B，终止反应，500nm比色。

试剂A：100mg的N-CBZ-Gln-Gly溶解于2mL、0.2mol/L的NaOH，依次加入0.2mol/L、pH 6.0的Tris-HCl缓冲液4mL，0.1mol/L的羟胺2mL，0.01mol/L的还原型谷胱甘肽2mL，并调节pH至6.0。

试剂B：3mol/L盐酸、12%三氯乙酸、5%FeCl₃·6H₂O（溶解于0.1mol/L的盐酸）按1:1:1的比例混合。