[发明专利]一种定量测定血液循环DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及血液循环DNA测定技术领域，具体是一种定量测定血液循环DNA的方法。

背景技术

血液循环DNA(Circulating DNA，ctDNA)，又称游离DNA或无细胞DNA(Cell-free DNA)，主要来源于细胞的凋亡和死亡。可作为肿瘤、自身免疫病及胎儿遗传学检测的依据。目前的检测方法均需要先从血清或血浆中提取DNA，然后扩增基因组中某个基因的方式，计算ctDNA的浓度或基因组拷贝数。由于个体间、不同病理状态间ctDNA含量及片段完整程度存在较大差异，即便不考虑操作者的因素，所用提取方法和试剂的不同就会造成提取效率存在巨大差别。在此基础上的ctDNA测定结果误差会更大。但直接用血浆或血清扩增，血清或血浆中含有的蛋白质等会严重干扰PCR，使标本间的扩增效率不一致。

此外，以SYBR Green为染料的定量PCR技术存在荧光染料信号强度低，灵敏度不高，对于低拷贝数的模板不容易检测到。

发明内容

为了克服以上技术缺陷，本发明提供一种快速准确的定量测定血液循环DNA的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为，一种定量测定血液循环DNA的方法，其步骤如下：

1、取1ml同一个肿瘤患者外周静脉血，置于EDTA抗凝管中，10℃-20℃静置4小时，2000g离心5分钟，取上层血浆100ul-200ul，加入相同体积的缓冲液，充分混匀，95℃静置5-10分钟，16000g离心10分钟，取上清液为模板直接用于定量PCR扩增；

2、取10ul上述处理后的血浆DNA，加入90ul的0.5×缓冲液稀释10倍，再取10ul稀释后的血浆DNA，加入90ul的0.5×缓冲液再稀释10倍，依次稀释下去，制备出不同稀释倍数的血浆；

3、分别取2ul不同稀释倍数的血浆直接进行定量PCR扩增，取PCR体系共20ul，包括快速复活热启动DNA聚合酶1ul、SuperGreen染料1ul、2x混合物10ul、终浓度为300nM的引物4ul以及H₂O4ul；95℃5分钟；95℃5秒，60℃20秒，72℃20秒，重复45个循环；

4、得出Cp值为23.51±0.03，26.87±0.03，30.45±0.12。

进一步，所述2x混合物包括2x反应缓冲液、终浓度为3mM的氯化镁、三磷酸脱氧核苷。

进一步，所述三磷酸脱氧核苷包括终浓度均为0.4mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。

进一步，所述不同稀释倍数的血浆的稀释倍数为1∶1、1∶10或者1∶100。

进一步，进行定量PCR扩增使用ROCHE LightCycler480定量PCR仪。

本发明所产生的有益效果为：1、通过特殊的技术工艺处理，可以直接用血浆或血清进行定量PCR反应，不影响PCR反应，扩增效率与提纯DNA相比一致，减少了DNA提取步骤和实验误差。2、采用新型的荧光染料SuperGreen，对PCR扩增过程中的抑制作用更轻微，可使用较高浓度，荧光信号值高、反应灵敏度高可精确检测出低至纳克水平的血浆游离DNA。3、试剂价钱便宜，减少了使用DNA提取试剂盒的费用等，操作简便。4、可用于大规模肿瘤高危人群筛查、肿瘤的早期诊断及疗效预后的动态观察。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式进行详细说明

图1为患者ctDNA的PCR扩增后的荧光信号分析图

图2为血浆ctDNA含量与荧光强度的相关性曲线图

具体实施方式

下面结合实例，对本发明进一步说明。

1.直接用血浆检测ctDNA与提纯的DNA为模板的扩增效率几乎一致；证明直接用血浆进行定量PCR反应，不影响PCR反应的效率，同时减少了DNA提取步骤和实验误差。

(1)取1ml同一个肿瘤患者外周静脉血，置于EDTA抗凝管中，10℃-20℃静置4小时，2000g离心5分钟，取上层血浆100ul-200ul，加入相同体积的缓冲液，充分混匀，95℃静置5-10分钟，16000g离心10分钟，取上清液为模板直接用于定量PCR扩增；

(2)取10ul上述处理后的血浆DNA，加入90ul的0.5×缓冲液稀释10倍，再取10ul稀释后的血浆DNA，加入90ul的0.5×缓冲液再稀释10倍，依次稀释下去，制备出不同稀释倍数的血浆；所述不同稀释倍数的血浆的稀释倍数为1∶1、1∶10或者1∶100。