[发明专利]用于同时检测沙门菌枸橼菌变形菌和爱德华菌的多重PCR引物及其设计方法

权利要求书

1.用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物，其特征在于为：

S.spp.F1：5’-GCCGGTAAACTACACGATGA-3’；

S.spp.R1：5’-GAGTTACTGAACCAACAGCT-3’；

C.freu.F1：5’-AACATAGCGATGGACAACTGA-3’；

C.freu.R1：5’-TTAGCAAAAATTTAAGCCGGT-3’；

P.mira.F1：5’-TTTATCAATAGCCTCAAACCCT-3’；

P.mira.R1：5’-TGCGTCACCCTCTAACTCATCC-3’；

E.tarda.F1：5’-CTGGGCAAGTATCCGACCTC-3’；

E.tarda.R1：5’-GGTAACCGTATCGGCGTAAG-3’；

其中，S．spp.为沙门氏菌的英文缩写，C．freu.为弗氏枸橼酸杆菌的英文缩写,P．mira.为奇异变形杆菌的英文缩写，E．tarda.为迟缓爱德华菌的英文缩写；

S.spp.F1和S.spp.R1为根据沙门氏菌FimA基因设计的上游引物F1和下游引物R1；C.freu.F1和C.freu.R1为根据弗氏枸橼酸杆菌Idh基因设计的上游引物F1和下游引物R1;P.mira.F1和P.mira.R1为根据奇异变形杆菌IdsC基因设计的上游引物F1和下游引物R1；E.tarda.F1和E.tarda.R1为根据迟缓爱德华菌FimA基因设计的上游引物F1和下游引物R1；

所述沙门氏菌引物对应的PCR扩增片段大小为526bp，弗氏枸橼酸杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为161bp，奇异变形杆菌引物对应的PCR扩增片段大小为396bp，迟缓爱德华菌引物对应的PCR扩增片段大小为330bp。

2.如权利要求1所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1，利用引物设计软件设计同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物组合，所形成的引物组合所包含的引物碱基数为20～24个，引物组合的熔解温度Tm值为52～62℃，引物组合的GC%为40%～60%；

步骤2，对引物组合中的引物进行筛选，保留不能合成引物二聚体的引物；

步骤3，判断所保留引物的竞争优劣状态，将步骤2所述保留不能合成引物二聚体的引物的GC%和碱基数进行比较，选取GC含量高的判断为竞争状态优势引物，进行步骤5；否则判断为竞争状态劣势引物，进行步骤4；

步骤4，再次筛选竞争状态劣的引物，具体步骤为：重复步骤2，对所保留的引物按照步骤3进行再次判断；

步骤5，利用PCR方法对竞争状态优引物进行扩增。

3.如权利要求2所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤1中，所述所用的引物设计软件为Primer Premier5.0。

4.如权利要求2所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤1中，所述多重PCR引物组合的熔解温度Tm值为60℃。

5.如权利要求2所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤2中，所述对引物组合中的引物进行筛选的具体步骤为：对所用的引物进行PCR扩增，筛选扩增效果最好的引物组合。

6.如权利要求2所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤2中，所述不能形成引物二聚体的引物的碱基数目为20～24。

7.如权利要求2所述用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物的设计方法，其特征在于在步骤5中，所述PCR方法的变性温度94℃，退火温度为60℃，延伸温度72℃。