[发明专利]用于同时检测沙门菌枸橼菌变形菌和爱德华菌的多重PCR引物及其设计方法

说明书

技术领域

本发明涉及沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的检测，尤其是涉及一种用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR引物及其设计方法。

背景技术

沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌、迟缓爱德华菌均属于肠杆菌科，可通过食物、伤口传播。除了引起食物中毒还能引起人和动物机体的多系统感染。

沙门氏菌为肠杆菌科细菌较早的成员，具有呼吸和发酵两种代谢类型，存在于温血及冷血动物体内、食物和环境中，是一种常见的病原菌，可以引起伤寒、肠伤寒、胃肠炎和败血症等相关疾病。沙门菌的血清型很多，给鉴定带来很大困难。沙门菌在自然界分布比较广泛，在外界环境中能生存较久，在水和土壤中能生存数周到数月，在冰库中甚至能存活半年以上。近年来，由于抗生素的滥用，该菌对氯霉素的耐药菌株明显增多，有的菌株对庆大霉素、卡那霉素、氨苄青霉素等也耐药，这使得食品安全中对该菌的检测投入了大量的人力物力。

弗氏枸橼酸杆菌，也被称为弗氏柠檬酸杆菌。曾被归于埃希菌属。柠檬酸杆菌属的细菌，具有如肠杆菌科的菌体、表面和鞭毛的相应抗原，有研究表明，柠檬酸杆菌中许多血清型的抗原与沙门菌属和埃希菌属的抗原有关，这个也给常规鉴定带来了一定困难。弗氏枸橼酸杆菌在自然界广泛分布，是人和多种动物包括哺乳类、鸟类、爬行类和两栖类的肠道常在菌，常见于粪便和被粪便污染的地方，也常见于土壤、水体和食物中，所以该菌也列在了大肠菌群。作为环境和食品等的粪源污染的卫生细菌学指标。该属的细菌作为人的条件致病菌，看在社区或者医院内发生感染，大多数感染部位是尿路和呼吸道，还可引起败血症、脑膜炎、骨髓炎、中耳炎及心内膜炎，在一定的数量下，还能引起食物中毒。对动物的致病性有明确记述的主要是鱼类，最近也有甲壳类和爬行类感染的报道，死亡率较高，对水产养殖影响不小，当前分子生物学鉴定还局限于对该菌的16SrRNA基因序列测定与系统发育学分析，时间周期太长，无法应用于日常监测和检测。

奇异变形杆菌亦被称作奇异杆菌，是变形杆菌属中较早的成员，对人类可引起原发性或继发性感染，也可以导致人类食物中毒，对动物也有致病作用。该属的细菌广泛存在于自然界中，尤其以奇异变形杆菌更为常见，它是一种已被确定的病原菌，或是单独或是与其他病原菌混合感染引起人的不同类型感染症，也是人尿路感染的一种主要病原，有的菌株还引起食物中毒，在呼吸道、消化道以及烧伤创面感染中的检出率也不断增加，是一种常见的医院感染菌。最重要的是，奇异变形杆菌能产生耐热肠毒素，引起相应的胃肠炎性食物中毒。

迟缓爱德华菌在试爱德华均属细菌中最早的成员，该菌能在特定条件下引起人的多种类型感染，也是鱼类常见的病原细菌，广泛存在于自然界中，此菌多从腹泻病人的粪便中分离到，而在健康人群的粪便中是极少分离到的。迟缓爱德华菌还能引起人的脑膜炎、腹膜炎、菌血症、败血症、皮肤软组织感染，发生肠道感染的临床表现类似沙门氏菌，虽然该菌被认定为人、鱼共染病原菌，但是主要发生在鱼类，甲壳类也是常见宿主，对养殖产业造成巨大影响。

目前，国内对沙门菌的检测已经有了相应的国家标准，分为以下几个过程:(1)前增菌；(2)选择性增菌；(3)选择性培养；(4)生化鉴定；(5)血清学实验。但国标方法步骤繁琐，费时费力，重复性不好，且弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的检测还没有建立相应的标准。因此，建立简便、快速、准确、可靠、的检测方法同时适用于这四种的检测，弥补目前检测方法的不足尤为重要。

多重PCR技术的应用，可大大减少检测成本，可大大减少工作量，适应于口岸快速检测的需要，是一种准确、可靠、科学的分子生物学方法。有鉴于此，尽快开发一种用于同时检测沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌和迟缓爱德华菌的多重PCR势在必行。