[发明专利]用于检测玉簪属植物病毒X的引物组及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检疫鉴定技术领域，涉及一种用于检测玉簪属植物病毒X的引物组及其应用。

背景技术

玉簪属植物病毒X（Hosta virus X，HVX）为甲型线形病毒科（Alphaflexiviridae）马铃薯X病毒属（Potexvirus）病毒，是一种专门侵染玉簪属植物（Hosta Tratt）的病毒，可导致玉簪（H.plantaginea Aschers.）和紫萼（H.ventricosa Stearn）等玉簪属植物花叶、斑驳及叶片脱水等症状。HVX可以通过种子、苗木以及园艺工具等途径传播。目前已见HVX报道的国家有荷兰、法国、韩国、美国。HVX传入美国后，已经对美国玉簪属植物造成了严重危害，产品损失巨大，严重影响到玉簪属植物的经济效益。美国已将HVX列为限定性非检疫性有害生物。为支持美国国内健康苗木计划（clean stock program），美国本土的玉簪属植物产品正朝着无HVX侵染的方向发展，为了响应HVX侵染导致严重的经济影响及支持国内健康苗木计划，美国动植物检疫局（简称APHIS）正在制定符合国内形势的玉簪属植物进口要求，APHIS将在进口港对所有进口的玉簪属植物材料进行HVX检测，若HVX侵染率高于5%则禁止进入。

玉簪属植物原产我国和日本，在我国分布甚广，其中玉簪（H.plantaginea Aschers.）和紫萼（H.ventricosa Stearn）等美丽的庭园观赏植物，多年来保持着良好的对外出口记录。为了保护我国的花卉产业，国家质检总局发出HVX的疫情警示，提醒广大花卉苗木进出口企业及各口岸检疫局，应加强HVX的专项检测，以消除隐患，确保我国花卉安全生产，同时促进我国的花卉出口。为了有效提高检测效率，需要建立相应的检测技术。

目前在玉簪属植物病毒X的检测上，较常用的方法有两种，一种是血清学检测方法，常见的有DAS-ELISA，血清学检测方法除了在灵敏度上存在不足外，其检测的特异性也受到限制（同属成员间的检测往往有交叉反应）；另一种是分子生物学检测方法，其中以RT-PCR最为常见，但是PCR需要特殊的仪器（PCR仪）。同时两者的检测需要较长的时间，血清学方法大约需要2天，分子生物学方法大约需要5小时，无法满足口岸快速检疫的要求。

环介导恒温核酸扩增技术（loop-mediatedisothermal amplification，LAMP），是由Notomi T等在2000年发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法，它是一种高灵敏的链置换技术。LAMP特点是针对靶基因的6个区域设计6条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶-Bst DNA polymerase在恒温（60℃-65℃）的条件下反应0.5-1小时即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果。不需要长时间的温度循环，不需要PCR仪等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。目前已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌及寄生虫等引起的疾病检测和快速诊断，且一些已获得专利授权，如在植物病毒上的有：一种利用LAMP快速检测中国番木瓜曲叶病毒的方法（申请号：201110119658.0；授权公告号：CN102154526B）、利用RT-LAMP方法快速检测植株中水稻黑条矮缩病毒（申请号：201110071894.X；授权公告号：CN102154518B）、利用RT-LAMP方法快速检测飞虱体内水稻黑条矮缩病毒（申请号：201110071930.2；授权公告号：CN102168151B）等。

LAMP方法由于具有反应时间短、无需特殊仪器、检测灵敏度高及特异性好的优点，很好的克服了当前所用DAS-ELISA及RT-PCR两类方法的不足，目前尚未见到使用该方法检测玉簪属植物病毒X的报道。LAMP方法既保证了检测的灵敏性和特异性，同时又简化了操作，节省了成本，为进出境检验检疫提供了一种简单而有效的方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测玉簪属植物病毒X的环介导等温扩增引物组。

本发明所提供的用于检测玉簪属植物病毒X的环介导等温扩增引物组，可为引物组A或引物组B；所述引物组A具体由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B具体由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；

所述引物1（F3）、所述引物2（B3）、所述引物3（FIP）、所述引物4（BIP）、所述引物5（LF）和所述引物6（LB）的的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。