[发明专利]抗体与微珠连接方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗体与微珠连接方法。

背景技术

自1979年将聚苯乙烯微珠成功磁化并与抗体连接后，即成为一种效果极佳的分离方法，引发了生物分离技术上的一次革命。该方法具有以下优点：（1）分离速度快、效率高、可重复性好；（2）操作简单、不需要昂贵的仪器设备；（3）比表面积大，可提高检测灵敏度；（4）不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能。

随着科学技术的发展以及纳米技术的推广，纳米材料已在生命科学研究领域发挥了重要作用。磁性纳米微珠作为一种新型的纳米技术，已经成功应用于核酸提取、废水处理、靶向药物、食品安全检测等系统上，并取得一定的进展。包被技术的进步能大大扩展磁性微珠的应用范围。因此，研究微珠表面的连接技术与方法，将使其运用至更广阔的分离、检测领域，并将极大地提高检测灵敏度。

食品安全事关广大人民群众的身体健康，受到政府和老百姓的高度关注。近年来食品质量问题十分突出，非法使用违禁药物、滥用抗生素，超量超范围使用兽药等都对群众身体健康造成了很大危害。针对以上问题，一方面要加强监管；另一方面要开发特异性的快速分离、检测方法。对磁性微珠表面包被特异性的抗体将是一种较为简便且高效的检测方面。包被方法多样，较为常用的是将抗体直接通过基团作用固定至微珠表面。然而此种方法灵敏度有限，抗体在微珠上的非特异性吸附将大大降低其检测效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能提高检测灵敏度的抗体与微珠连接方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗体与微珠连接方法，包括以下步骤：

1）、抗体与核苷酸交联：

A、抗体的修饰与脱盐：

25～100μg免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称IgG）稀释成浓度为2～8mg/mL后与SANH（Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone）均匀混合后，于20～30℃的摇床中孵育修饰2～6小时，SANH与免疫球蛋白的摩尔比为10～70：1；

将所得的抗体修饰产物经洗涤、离心过滤，以除去多余的SANH；得脱盐后的抗体修饰产物；测IgG的蛋白浓度，待用（目的是：计算修饰、脱盐步骤后抗体的回收率，避免因为超滤膜或操作问题导致样品过分损失。）

B、核苷酸的修饰与脱盐：

用pH7.0～7.6的磷酸缓冲液将核苷酸（寡核苷酸）稀释至6～12mg/mL，加入SFB（Succinimidyl 4-formylbenzoate）均匀混合，于20～30℃的摇床中孵育修饰2～6小时，SFB与核苷酸（寡核苷酸）的摩尔比为10～70：1；

备注说明：上述核苷酸序列为GGGAA ATCTC TGCAG GCAAA TGTGA（5’～3’），3’端修饰了氨基；

将所得的核苷酸修饰产物经洗涤、离心、过滤，以除去多余的SFB；得脱盐后的核苷酸修饰产物；测核苷酸浓度，待用（目的是计算修饰、脱盐步骤后寡聚核苷酸的回收率，避免因为超滤膜或操作问题导致样品过分损失。）

C、修饰后抗体与核苷酸的交联与纯化

将脱盐后的抗体修饰产物（为修饰成功的脱盐后的抗体修饰产物）和脱盐后的核苷酸修饰产物（为修饰成功的脱盐后的核苷酸修饰产物）按照1:8～12的摩尔比均匀混合，于2～8℃充分反应8～24小时，

将所得的交联后产物经洗涤、离心、过滤，除去游离寡核苷酸并进行脱盐；得纯化后的抗体—核苷酸交联体；

在350nm下测定吸光值，待用（抗体和寡核苷酸的修饰基团在交联的过程中生成稳定存在的腙键，该腙键在350nm下有特异吸收峰；因此测定350nm是否有明显吸收峰生成是验证交联成功的有力证明；通过测定350nm下特异吸收峰值，可进一步计算出交联产物的浓度）；

2）、抗体—核苷酸交联体与微珠作用：

微珠先经洗涤液洗涤，然后静置；

将1～9×10^-11mol biotin修饰的核苷酸（序列为TCACA TTTGC CTGCA GAGAT TTCCC5’～3’,3’biotin修饰）加入5～15μl的Neutravidin包被的磁珠，于20～30℃的摇床孵育10～30分钟，接着用洗涤液洗涤；随后加入上述5～10×10^-13mol纯化后的抗体—核苷酸交联体，在6×SSPE缓冲液（pH6.0）条件下于20～30℃的摇床孵育1～4小时，再用洗涤液洗涤；得微珠体系；