[发明专利]PCR酶切分型快速鉴定土壤和环境水中军团菌的方法

权利要求书

1.一种PCR酶切分型快速鉴定土壤和环境水中军团菌的方法，其特征在于步骤如下：

（1）针对军团菌特异位点设计并合成一对引物；

（2）配制CTEN基因组DNA提取液；

（3）提取DNA；

（4）PCR扩增；

（5）琼脂糖凝胶电泳；

（6）酶切分析。

2.权利要求1所述的方法，其中针对军团菌特异位点设计的引物中：

上游引物为Leg 557F，其序列为SEQ ID NO：1，

下游引物为Leg 557R，其序列为SEQ ID NO：2。

而且其中，

（2）中的CTEN基因组DNA提取液成分为：

Chelex-100溶液  5%

三羟甲基氨甲烷盐酸盐  10mM

乙二胺四乙酸二钠  0.1mM

叠氮钠  0.1%

蛋白酶K  100μg/ml；

（3）DNA提取的具体步骤为：

样本离心沉淀后，于沉淀物种中加入CTEN基因组DNA提取液60μl，充分混匀，55℃水浴30min，100℃水浴10min，离心后，上清液即是提取的基因组DNA模板；

（4）PCR扩增的具体步骤为：

PCR反应体系为上游引物和下游引物各1μl，PCR Master Mix 12.5μl，双蒸水 5.5μl，基因组DNA模板5μl，总体系25μl；

PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行30～40个循环；72℃保温5min

（5）琼脂糖凝胶电泳的具体步骤为：

取PCR扩增产物5μl经琼脂糖凝胶电泳，如有557bp条带出现则认为军团菌阳性，反之，则认为军团菌阴性；

（6）酶切分析的具体步骤为：

取上述（5）阳性PCR产物10μl于PCR管中，加入2μl 10×Buffer，1μl限制性内切酶FastDigest HinfⅠ酶，用17μl双蒸水补足至30μl，37℃水浴5min后，取8μl PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行分析；嗜肺军团菌可被消化为400bp和157bp片段，而非嗜肺军团菌中的阿德莱德军团菌、釜山军团菌和伦敦军团菌可被消化为约257bp和150bp片段，其他非嗜肺军团菌不被消化，仍为557bp，据此可区分鉴别嗜肺军团菌。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶切反应使用的限制性内切酶为限制性核酸内切酶HinfⅠ的同裂酶，即识别位点为“GANTC”的所有内切酶。