[发明专利]PCR酶切分型快速鉴定土壤和环境水中军团菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及军团菌检测鉴定的技术领域，具体为一种通过PCR检测军团菌，再通过酶切技术鉴定嗜肺军团菌的一种方法。

背景技术

军团菌是一种兼性胞内寄生菌，广泛分布在土壤和环境水系统中。是引起军团菌病的重要病原体。目前已确认军团菌有58个种，70多个血清型，但嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）与人类的疾病关系最为密切，据报道，临床上约90%的军团菌病是由嗜肺军团菌引起。因此，军团菌尤其是嗜肺军团菌的快速鉴定显得尤为重要。

目前的军团菌检测鉴定主要依靠军团菌分离培养、生化试验反应、血清学反应、脂肪酸成分分析、多重PCR检测、RT-PCR及基因测序等，但传统的军团菌分离培养法所需时间长，阳性率低，培养基的配置复杂，价格昂贵，且需要专业的技术人员；生化实验对于大量菌株的分类鉴定繁琐费时、准确性较差；血清学检测成本高昂，且易产生交叉反应；脂肪酸成分分析操作复杂，且易受细菌生长条件的影响；多重PCR检测特异性较差；RT-PCR检测及基因测序检测方法虽能准确的鉴定军团菌，但对仪器设备要求高，且耗时长、花费高。因此，一种快速、可靠、且成本低廉的方法鉴定军团菌及嗜肺军团菌是很有必要的。

PCR方法具有很高的特异性与敏感性，它在检测军团菌中有着很广泛的应用，可以通过PCR方法检测军团菌中的特异基因，达到快速检测军团菌的目的。目前可以通过PCR扩增军团菌16S rRNA基因、5S rRNA基因、23S与5S之间的间隔基因、巨噬细胞感染力增强因子（mip）基因检测军团菌。相对而言，16S rRNA基因片段，在军团菌属中最为保守，具有更好的属特异性。

发明内容

为了克服现有技术的障碍，本发明基于在16S rRNA基因序列中一个嗜肺军团菌特异的酶切位点，建立一种更为简单、快速、且成本低廉的方法对军团菌及嗜肺军团菌进行准确鉴定。

本发明是这样实现的：一种PCR酶切分型快速鉴定土壤和环境水中军团菌的方法，步骤如下：

（1）针对军团菌特异位点设计并合成一对引物；

（2）配制CTEN基因组DNA提取液：

（3）提取DNA；

（4）PCR扩增；

（5）琼脂糖凝胶电泳；

（6）酶切分析。

进一步地，其中针对军团菌特异位点设计的引物中：

上游引物为Leg 557F，其序列为SEQ ID NO：1，

下游引物为Leg 557R，其序列为SEQ ID NO：2。

进一步地，各个具体成分、步骤为：

（2）中的CTEN基因组DNA提取液成分为：

Chelex-100溶液  5%

三羟甲基氨甲烷盐酸盐  10mM

乙二胺四乙酸二钠  0.1mM

叠氮钠  0.1%

蛋白酶K  100μg/ml

（3）DNA提取的具体步骤为：

样本离心沉淀后，于沉淀物种中加入CTEN基因组DNA提取液60μl，充分混匀，55℃水浴30min，100℃水浴10min，离心后，上清液即是提取的基因组DNA模板；

（4）PCR扩增的具体步骤为：

PCR反应体系为上游引物和下游引物各1μl，PCR Master Mix 12.5μl，双蒸水 5.5μl，基因组DNA模板5μl，总体系25μl；

PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，进行30～40个循环；72℃保温5min

（5）琼脂糖凝胶电泳的具体步骤为：

取PCR扩增产物5μl经琼脂糖凝胶电泳，如有557bp条带出现则认为军团菌阳性，反之，则认为军团菌阴性；

（6）酶切分析的具体步骤为：

取上述（5）阳性PCR产物10μl于PCR管中，加入2μl 10×Buffer，1μl限制性内切酶FastDigest HinfⅠ酶，用17μl双蒸水补足至30μl，37℃水浴5min后，取8μl PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行分析；嗜肺军团菌可被消化为400bp和157bp片段，而非嗜肺军团菌中的阿德莱德军团菌、釜山军团菌和伦敦军团菌可被消化为约257bp和150bp片段，其他非嗜肺军团菌不被消化，仍为557bp，据此可区分鉴别嗜肺军团菌。

所述酶切反应使用的限制性内切酶为限制性核酸内切酶HinfⅠ的同裂酶，即识别位点为“GANTC”的所有内切酶。