[发明专利]一种自诱导培养基及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，尤其涉及一种自诱导培养基及其应用。

背景技术

青霉索G酰胺酶（EC3.5.1.11）是半合成β-内酰胺类抗生素工业的重要酶，主要用于水解青霉素或头孢菌素分别生成母核6-APA（6-氨綦青霉靛酸）或7-ADCA（7-氨基头孢烷酸）。

此酶属于水解酶家族，作用于肽键以外的碳-氮键，特别是在直链酰胺键。系统的名字是青霉素水解酶，其他共同的使用的名字包括青霉素酰化酶，脂肪酶Novozym217，α-酰基-β-内酰胺水解酶，氨苄青霉素酰化酶。目前该酶已大规模应用于工业生产β-内酰胺类抗生素的关键中间体和半合成β-内酰胺类抗生素。

在基因工程菌中表达青霉素酰胺酶时，常选用基于强启动子T7的表达系统。这类表达系统中，T7RNA聚合酶能特异识别T7启动子，从而开启下游基因的大量转录，有效地启动目的蛋白的表达。

但是基于T7启动子的表达系统也有其不足之处。蛋白的表达需要用IPTG诱导，步骤比较繁琐。而且，一定浓度的IPTG会对细菌产生毒性，直接影响蛋白的表达效率。另外，由于lac mRNA本底水平的组成型合成，可导致目的蛋白的少量表达。研究表明，非目的性表达出的目的蛋白可能会导致目的蛋白的不稳定、甚至不表达。此外，目前培养大肠杆菌一般使用LB培养基，其组分之一是胰蛋白胨，由于胰蛋白胨是使用胰酶消化酪蛋白后的产物，而酪蛋白一般是从牛奶或大豆中提取的，因此，胰蛋白胨中存在的微量乳糖成分会促进细菌产生非目的性表达，从而影响表达量。

利用自诱导培养基培养细菌使之表达外源蛋白的方法解决了上述技术问题。公开号为CN101235362B的中国专利文献公开了一种用于原核表达系统表达外源蛋白的复合自动诱导培养基，每升培养基中含有以下重量的各组分：胰蛋白胨10～40g，酵母提取物5～20g，六水琥珀酸钠0～8.1g，二水柠檬酸钠0～1.5g，甘油15～50g，葡萄糖0.5g，乳糖2g，磷酸二氢钠3.55g，磷酸二氢钾3.40g，氯化铵2.68g，硫酸钠0.71g，七水硫酸镁0.50g，六水氯化铁0.03g。

在培养基中同时加入葡萄糖和乳糖，大肠杆菌会优先利用葡萄糖，在葡萄糖耗尽前不会诱发lac启动子；当葡萄糖耗尽时，乳糖发挥作用，开启lac启动子诱导外源蛋白表达，而乳糖的代谢产物也同时作为细菌生长的碳源。自诱导的方法省去了监测培养基的菌密度和添加IPTG诱导蛋白表达的步骤，一方面使得实验操作更加简洁，另一方面避免了IPTG对细菌的毒害作用。

但现有的自诱导培养基的配方仍可继续完善，以提高目的蛋白的表达量。

发明内容

本发明提供了一种用于原核表达系统的自诱导培养基，该培养基能高效诱导表达外源蛋白。

一种用于原核表达系统的自诱导培养基，配方为：阿拉伯糖2～10g/L，葡萄糖0.5～2.5g/L，甘油5～25g/L，蛋白胨8～12g/L，磷酸盐6.5～7.4g/L，硫酸盐1.1～1.3g/L，NH₄Cl2.6～2.7g/L，痕量元素溶液适量。

更优选地，配方为：阿拉伯糖2～5g/L，葡萄糖0.5～1g/L，甘油5～15g/L，蛋白胨9～11g/L，磷酸盐6.7～7.1g/L，硫酸盐1.15～1.25g/L，NH₄Cl2.65～2.7g/L，痕量元素溶液适量。

所述自诱导培养基中添加有磷酸盐，用于保持自诱导培养基的pH，避免pH太低影响细胞生长。所述磷酸盐优选为KH₂PO₄和Na₂HPO₄中的至少一种。当同时选用KH₂PO₄和Na₂HPO₄时，KH₂PO₄的添加量优选为3.3～3.5g/L，Na₂HPO₄的添加量优选为3.4～3.6g/L。

所述硫酸盐优选为MgSO₄和Na₂SO₄中的至少一种。当同时选用MgSO₄和Na₂SO₄时，MgSO₄的添加量优选为0.45～0.50g/L，Na₂SO₄的添加量优选为0.70～0.75g/L。