[发明专利]鹅T细胞表面分子CD8α的检测试剂盒与方法

权利要求书

1.鹅T细胞表面分子CD8αmRNA水平的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A PCR扩增

以如SEQ ID NO：1所示的cDNA为模板，以如SEQ ID NO：2所示的序列为正向引物，如SEQ ID NO：3所示的序列为反向引物，进行PCR扩增；

B判断结果

在反应体系中进行PCR扩增不少于20个循环后，对PCR产物进行检测，并进一步判断mRNA是否存在、mRNA的相对含量或mRNA的绝对含量。

2.根据权利要求1所述的鹅T细胞表面分子CD8αmRNA水平的检测方法，其特征在于，所述检测方法为实时荧光定量PCR法，采用SYBR Green I为荧光染料，具体包括以下步骤：

A PCR扩增

以如SEQ ID NO：1所示的cDNA为模板，以如SEQ ID NO：2所示的序列为正向引物，如SEQ ID NO：3所示的序列为反向引物，进行PCR扩增；同时设定已知量的标准组；

B判断结果

在反应体系中进行PCR扩增40个循环后，将待测样品与标准组进行荧光强度比较，判定待测样品mRNA的量。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A中，以鹅的β-actin作内参基因设计引物，其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤A中，引物的终浓度为0.3μmol/L。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤A中，所述引物第一阶段95℃ 3min；第二阶段95℃ 30s，61.4℃ 30s，各40个循环进行反应；所述内参引物第一阶段95℃ 3min；第二阶段95℃ 30s，60℃ 30s，各40个循环进行反应。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准组的标准样品为重组质粒pGEM-T-goCD8α，重组质粒pGEM-T-goCD8α由如SEQ ID NO：6所示的目的片段和pGEM-T easy连接并转化而得。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述重组质粒pGEM-T-goCD8α，将其以10倍体积梯度递增稀释6次，进行荧光定量PCR反应，得标准曲线。

8.鹅T细胞表面分子CD8α的cDNA序列及其编码的氨基酸，其特征在于，所述cDNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

9.基于实时荧光定量PCR的鹅T细胞表面分子CD8α的mRNA定量试剂盒，所述mRNA定量试剂盒包括组织RNA提取液、PCR扩增反应液，其特征在于：所述PCR扩增反应液中用于目的片段扩增的正向引物和反向引物，所述正向引物从5’到3’的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物从5’到3’的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

10.根据权利要求9所述的mRNA定量试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因PCR扩增反应液，所述正向内参引物从5’到3’的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述内参反向引物从5’到3’的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述试剂盒还包括阴性质控品、阳性质控品。