[发明专利]鹅T细胞表面分子CD8α的检测试剂盒与方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物免疫分子检测，特别涉及鹅T细胞表面分子CD8α的检测技术。

背景技术

T淋巴细胞是一类重要的免疫活性细胞，除直接介导细胞免疫功能外，还对机体免疫应答的调节起关键作用。T细胞在发育的不同阶段，细胞表面可表达不同种类的受体和T细胞抗原，T细胞本身的识别活化及效应功能的发挥就与这些受体和抗原密切相关。在细胞免疫中，T细胞对抗原的识别过程中需要依赖TCR(Thyristor Controlled Reactor)和MHC(Major Histocompatibility Complex)分子的相互识别和作用。CD8分子就扮演着这样的介导作用。CD8分子是T淋巴细胞表面的一种跨膜糖蛋白，主要表达在细胞毒性T淋巴细胞、抑止性T细胞、自然杀伤性细胞表面，负责与I型MHC分子相识别。在免疫应答中，CD8分子的功能主要表现为粘附功能与信号传递作用。CD8分子包括alpha(α)与beta(β)两个亚型，以同二聚体CD8αα及异二聚体CD8αβ的形式而发挥免疫学功能。因此，我们只需要检测到CD8α分子的存在即可推断检测到CD8+的T淋巴细胞。

实时荧光定量RT-PCR可准确检测目的基因的mRNA表达情况，具有高特异性、重复性好、操作简单，检测快速、灵敏度高，样品消耗少、无需电泳、结果简单易懂等优点，已成为基因表达定量检测的金标准。

目前，禽类包括鸡、北京鸭、麻鸭、樱桃谷鸭的CD8a的cDNA序列已经先后陆续被报道，关于鹅CD8a的cDNA序列至今未见报道，也未见关于鹅T细胞表面分子CD8a表达实时定量检测方法的研究。该方法的建立，意义重大，其不仅可应用于监控养殖场鹅机体细胞免疫状态，监控养殖鹅被疫苗免疫后或者实施免疫增强剂后鹅机体T细胞免疫的波动情况，还可应用于在疾病感染过程中检测鹅宿主细胞免疫系统的变化，更可应用于在科学研究中探讨或寻找更有效的鹅类免疫刺激剂或免疫增强剂或疫苗佐剂等。另外，该方法为研发鹅类免疫刺激剂或免疫增强剂或疫苗佐剂提供了检测手段。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种鹅T细胞表面分子CD8a基因的mRNA水平的检测方法，该方法特异性高，灵敏度高。本发明的另一目的在于提供一种上述检测方法为检测原理的检测试剂盒，其检测结果特异性高，操作简单。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

鹅T细胞表面分子CD8α的mRNA水平的检测方法，包括定性和定量检测，具体包括以下步骤：

A PCR扩增

以如SEQ ID NO：1所示的cDNA为模板，以如SEQ ID NO：2所示的序列为正向引物，如SEQ ID NO：3所示的序列为反向引物，进行PCR扩增；

B判断结果

在反应体系中进行PCR扩增不少于20个循环后，对PCR产物进行检测，并进一步判断鹅CD8a的mRNA是否存在、mRNA的相对含量或mRNA的绝对含量，即定性检测或定量检测。常规PCR反应体系参见实施例1表2。

mRNA定量分析主要依赖实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)进行操作，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板(引物所针对的特定RNA)进行定量分析。依据其采用荧光标记的不同，可分为非特异性荧光标记和特异性荧光标记。非特异性荧光标记用于相对定量mRNA的检测，特异性荧光标记用于绝对定量mRNA的检测。

进一步，所述的鹅T细胞表面分子CD8α的mRNA水平的检测方法为实时荧光定量PCR法，采用SYBR GreenI为荧光染料，具体包括以下步骤：

A PCR扩增

以如SEQ ID NO：1所示的cDNA为模板，以如SEQ ID NO：2所示的序列为正向引物，如SEQ ID NO：3所示的序列为反向引物，进行PCR扩增；同时设定已知量的标准组；

B判断结果

在反应体系中进行PCR扩增40个循环后，将待测样品与标准组进行荧光强度比较，判定待测样品mRNA的量；反应体系参见具体实施方式中的表4。

SYBR Green I染料为非特异性荧光标记物，用于mRNA相对定量分析。它可结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。所以，引物设计非常关键，否则会出现非特异性扩增。