[发明专利]一种结核分枝杆菌CFP10抗原蛋白串联重组表达方法及其在结核检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域及医学免疫学领域，具体涉及结核病病人和结核杆菌感染者的快速、早期特异的检测方法，具体的涉及一种结核分枝杆菌CFP10串联重组融合蛋白及其应用，特别是一种结核病抗原CFP10串联重组融合蛋白特异的全血IFN-γ结核诊断试剂盒及TCELL-SPOT结核感染诊断试剂盒的制作方法和应用方法。

背景技术

结核病是由结核分支杆菌(Mycobacterium tubercu1osis, MTB)感染所致的人类疾病，主要通过呼吸道传播，且疫情发展日趋严重。结核病的预防、早期诊断和及时治疗意义重大。MTB标准菌株H37Rv被广泛应用于TB相关的生物医药研究，其特异性抗原的制备备受关注。目前常用的结核特异抗原可以通过基因工程方法大量制备，是结核诊断的基础。但是目前多集中于单独一种抗原的表达、单独抗原表位的表达、多种抗原联合表达的方法获得结核特异抗原，少有单一抗原串联重组表达的研究，且结核特异性抗原多直接用血清学方法检测结核感染，灵敏度低、特异性差。

发明内容

为克服上述现有技术的不足，本发明提供一种用基因工程方法生产的结核CFP10串联重组融合蛋白作为抗原，特异性强且易于纯化，用其作为特异抗原制备了全血IFN-γ结核诊断试剂盒及TCELL-SPOT结核感染诊断试剂盒，为结核病感染的检测提供更为特异、灵敏、准确的工具。

一种编码结核分枝杆菌CFP10的密码子优化基因序列，其单拷贝核昔酸序列CFP10c1如SEQ ID NO.1所示，2次拷贝串联核苷酸序列CFP10c2如SEQ ID NO.2所示，3次拷贝串联核苷酸序列CFP10c3如SEQ ID NO.3所示，4次拷贝串联核苷酸序列CFP10c4如SEQ ID NO.4所示，5次拷贝串联核苷酸序列CFP10c5如SEQ ID NO.5所示，6次拷贝串联核苷酸序列CFP10c6如SEQ ID NO.6所示，CFP10基因串联次数包括但不限于1－6次。

结核分枝杆菌CFP10串联重组融合蛋白，它由所述的密码子优化基因序列编码，其单拷贝氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，2次拷贝氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，3次拷贝氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，4次拷贝氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，5次拷贝氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，6次拷贝氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，CFP10蛋白串联次数包括但不限于1－6次。

结核分枝杆菌CFP10串联重组融合蛋白的表达载体，其将上述的密码子优化基因序列分别插入到质粒pET-16b上，得到重组质粒CFP10c1-pET16b、CFP10c2-pET16b、CFP10c3-pET16b、CFP10c4-pET16b、CFP10c5-pET16b或CFP10c6-pET16b，载体包括但不限于pET16b。

一种表达结核分枝杆菌CFP10串联重组融合蛋白的工程菌株，它含有上述的表达载体，其宿主菌为大肠杆菌（Escherichia coli）。

一种基于所述结核分枝杆菌CFP10串联重组融合蛋白建立的体外检测结核杆菌感染的化学发光法试剂盒，其利用上述的结核分枝杆菌CFP10串联重组融合蛋白，刺激受检者的外周血释放γ-干扰素，并通过化学发光方法测定γ-干扰素的变化，诊断是否感染结核分枝杆菌。

一种基于所述结核分枝杆菌CFP10串联重组融合蛋白建立的体外检测结核杆菌感染的TCELL-SPOT试剂盒，其上述的结核分枝杆菌CFP10串联重组融合蛋白，刺激受检者的外周血T淋巴细胞，并通过ELISPOT方法测定斑点形成的多少，诊断是否感染结核分枝杆菌。

所述的结核分枝杆菌CFP10串联重组融合蛋白在制备单抗、多抗、检测试剂盒及蛋白芯片中的应用。

附图说明

图1  重组质粒CFP10c1-pET16b的构建示意图；

图2  重组质粒CFP10c2-pET16b的构建示意图；

图3  重组质粒CFP10c3-pET16b的构建示意图；

图4  重组质粒CFP10c4-pET16b的构建示意图；

图5  重组质粒CFP10c5-pET16b的构建示意图；

图6  重组质粒CFP10c6-pET16b的构建示意图；